Attività catalitica delle diastasi
Buongiorno :-)
Riporto un esperimento fatto ieri, di semplice esecuzione e di forte impatto didattico (secondo me).

Cenni teorici

Le diastasi sono un gruppo di enzimi in grado di scindere carboidrati complessi in carboidrati più semplici. La classificazione odierna le identifica con le amilasi (alfa, beta e gamma-amilasi). Le amilasi appartengono alla classe delle idrolasi, degli enzimi che scindono legami idrolizzandoli. Nello specifico, sono delle glicoside idrolasi (o glicosidasi), proprio perché rompono il legame glicosidico tra un anello zuccherino e l'altro.

Ovviamente, parlando di enzimi, cioè di proteine molto specifiche e differenti tra specie e specie, sarebbe sbagliato dire 'la diastasi', o 'l'amilasi': tali nomi non identificano univocamente degli enzimi, ma un insieme di questi che hanno funzione identica ma differenti caratteristiche biochimiche.

Esempi di amilasi sono le alfa-amilasi umane, secrete dalle ghiandole salivari (ptialina, amilasi salivare) e dal pancreas esocrino (amilasi pancreatica). Una prossima esperienza potrebbe essere quella di osservare l'attività di questi enzimi estratti dall'uomo. Per ora mi sono limitato alle amilasi d'orzo (in prevalenza beta amilasi, di seguito la ricostruzione dal PDB).  

   

In questa esperienza, adattata da 'Practical organic chemistry di F.G. Mann e B.C. Saunders, IIed., 1938', ho provato a verificare l'attività delle diastasi estratte dal malto d'orzo (reperibile in supermercati di roba biologica-naturale-senzaogm-senzaglutine-senzaniente-, foto di seguito) su dell'amido che ho estratto, per passatempo, da delle patate (secondo la procedura di NileRed su youtube, seconda foto di seguito), con l'aiuto di una soluzione di iodio (la tintura da farmacia, contenente iodio, KI in acqua ed etanolo). 

        
Lo iodio in soluzione, classica nozione da liceo (magari non più fra qualche anno, tanto a che serve saperlo?  no no ), forma un complesso con le catene elicoidali di amilosio nell'amido, complesso di un bel colore viola. Su questo si basano il saggio di Lugol e certe procedure di analisi quantitativa. Mettendo a contatto l'amido e le diastasi estratte, però, i prodotti della catalisi sono catene zuccherine via via più corte, dette destrine, fino ad arrivare al maltosio, un disaccaride (glucosio+glucosio): questi prodotti non danno più la colorazione blu nel test dello iodio, quindi saggiando la miscela di reazione con iodio ogni tot minuti, si osserverà un passaggio di colore dal viola scurissimo all'incolore (o al giallo della soluzione di iodio). Nello specifico, le principali destrine formate sono, in ordine di apparizione: amilodestrina (violetto con iodio), eritrodestrina (rossiccio) e acrodestrina (nessuna colorazione).

Parte I - Verifica della catalisi 

Materiale:

- malto d'orzo
- acqua distillata
- vetreria semplice
- piastra riscaldante e materiale per bagnomaria
- provette e portaprovette
- materiale per filtrazione a vuoto
- pipette graduate
- soluzione di iodio 1% (o tintura di iodio da farmacia di concentrazione all'incirca uguale)
- mortaio
- amido di patate (dovrebbe andar bene anche di mais o altro)

Procedura:

  1. Si mescolano triturando in un mortaio 10 g di malto d'orzo e 50 ml di acqua distillata. Io li ho posti in becher su agitatore magnetico, per non stare sempre ad agitare, ma è uguale. Si tengono per un ora, mescolando ogni tanto, poi si filtra su Buchner (ci vuole tempo perché filtri), tenendo il filtrato. Di seguito le foto:
             ;
  2. Si sospendono 3 g di amido in 10 ml di dH2O, e si versano, mescolando, in 90 ml di acqua distillata bollente contenuti in una beuta da 300 ml;
  3. Si lascia freddare il contenuto fino a circa 70 °C, e si pone a bagnomaria mantenendo la temperatura fra i 65 e i 70 °C, avendo cura di non andare oltre;
  4. Preparare una serie di provette  (io ne ho messe 10) contenenti ciascuna 10 ml di acqua distillata e due gocce di soluzione di iodio all'1%. Di seguito, la serie di provette:
       ;
  5. Si aggiungono, annotando l'orario, 3 ml dell'estratto di malto (il filtrato del punto 1) nella soluzione di amido, mantenendo sempre in bagno termostatico;
  6. Ogni 4 minuti dall'aggiunta dell'estratto, si preleva con una pipetta graduata 1 ml di miscela di reazione e si versa in una delle provette, annotando il colore;
  7. Si procede sino ad assenza di viraggio della soluzione di iodio.
      
Risultati:

Segue la sequenza di provette, comprendente tutti gli stadi di colore osservati. Si nota, da sx a dx, un viola scurissimo, quasi nero, passando al violetto, violetto sbiadito, rosso-violetto, giallino-rossiccio, giallino.

        

Parte II - Verifica della presenza di maltosio

Ho provato a testare la miscela, il giorno dopo, con il saggio di Fehling dei carboidrati riducenti, per verificare la presenza di maltosio. Questo disaccaride, infatti, è in grado di ridurre il rame bivalente del reattivo in rame monovalente, che precipita come Cu2O, rosso. L'amido, invece, non ha tale capacità, risultando negativo al saggio (rimane blu).

Materiale:

- reattivo di Fehling A (6,93 g di solfato di rame portati a 100 ml con acqua);
- reattivo di Fehling B (34,6 g di sale di Rochelle e 10 g di NaOH portati a 100 ml);
- materiale per bagnomaria;
- becher e provette;
- amido;
- miscela di reazione (dalla Parte I).

Procedura:

  1. Si preparano 3 provette pulite (segnate con A=amido, M=maltosio e B=bianco) e si versano in ciascuna 1 ml di Fehling A e 1 ml di Fehling B. Si deve avere una soluzione limpida blu scuro;
  2. Si aggiungono: in A 1 ml di soluzione di amido (se ne scioglie una punta di spatola in 5 ml di acqua bollente); in M 1 ml della miscela di reazione amido-diastasi; in B 1 ml di acqua distillata;
  3. Si pongono le tre provette a bagnomaria bollente per pochi minuti, osservando il risultato.
Risultati:

Nella foto a sinistra, le tre provette prima del test; nella foto a destra, le tre provette dopo il test (da sx a dx: A, M, B). Il precipitato arancio è ben evidente, e dimostra la presenza di un carboidrato riducente nella miscela, confermando ulteriormente l'avvenuta catalisi.

        

Conclusioni:

Sono ben accette correzioni e suggerimenti per implementare l'esperimento, magari con enzimi estratti da altre fonti o cose simili. Sempre nel Mann si suggerisce di precipitare la destrina dalla miscela, filtrando e collezionando una soluzione, fra le altre cose, di maltosio. Propone poi di produrre maltosazone (si dice così, in italiano?) aggiungendo al filtrato fenilidrazina in acido acetico. Io non ho né il materiale né, per ora, le conoscenze per farlo. Se qualcuno è interessato me lo dica e trascrivo la procedura :-) .
"C'è uno spettacolo più grandioso del mare, ed è il cielo, c'è uno spettacolo più grandioso del cielo, ed è l'interno di un'anima." V. Hugo, I Miserabili.
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Io quasi ogni giorno uso le due soluzioni di Fehling per la ricerca delle bozzime :-D
Interessante la cosa. Bravo.
Sensa schei né paura ma coa tega sempre dura
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(2016-07-30, 16:45)quimico Ha scritto: Io quasi ogni giorno uso le due soluzioni di Fehling per la ricerca delle bozzime :-D
Interessante la cosa. Bravo.

Molte grazie  :-D

Una cosa OT che non ho mai capito: il Fehling per quanto tempo si può conservare? Ovviamente intendo le due soluzioni separate. Perché ho dei vaghi ricordi su delle raccomandazioni che mi avevano fatto a scuola di usarli entro poco tempo. O mi confondo con il reattivo una volta uniti A e B, che si mantiene poco?
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Hanno brève durata quando uniti...perchè uno è Una soluzione di solfato rameico, mentre l'altro è Una soluzione di idrossido di sodio e tartrato sodico-potassico...non credo si degradino da separati
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Le soluzioni che uso io sono in frigo e durano poco tempo perché ne usiamo spesso 200mL di ognuna a volta.
Hanno una data di scadenza ovviamente ma non arrivano mai ad essa perché sono molto usate.
Noi per Accredia abbiamo tempistiche serrate per i reagenti e gli standard ma non ricordo quanto durino.
Se male conservate si degradano facilmente e le si getta nel cesso facilmente... E sono soldi buttati.
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La soluzione A dura per sempre. E' solo solfato di rame. Ricordo che al liceo da noi se ne usava una vecchia di trent'anni, e funzionava. Per la soluzione B direi che almeno 10 anni dovrebbe durare. Unite ovviamente hanno vita molto breve. A casa ho mezzo litro di A dei primi anni '90 e funziona ancora.
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