Attività enzimatica e curva di calibrazione
Salve a tutti, avrei un dubbio riguardo un protocollo da laboratorio che abbiamo seguito all'università per 6 settimane.
Gli esperimenti riguardano la reazione tra la fosfatasi alcalina e il p-nitrofenolo e sono 5: la prima parte chiede di preparare sette campioni a diverse concentrazioni di p-nitrofenolo con soluzione tampone e di misurarne l'assorbanza per tracciare una curva di calibrazione con i valori di assorbanza. Gli altri esperimenti sono: "Misurazione dell'attività dell'enzima fosfatasi alcalina", "L'effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione", "L'effetto del pH sull'attività dell'enzima" e "L'effetto della temperatura sulla reattività". Per ognuno di questi esperimenti si richiede di calcolare la quantità di prodotto o di enzima tramite spettroscopia e tracciare grafici tenendo conto della curva di calibrazione che doveva essere tracciata (ovviamente dopo aver eseguito l'esperimento nuovamente) ogni settimana. 
Il punto è questo: perchè si deve tener conto della curva di calibrazione per i risultati degli altri esperimenti? Ad esempio, se costruisco un grafico con ascissa=valore di assorbanza e ordinata=volume di nitrofenolo e traccio la curva di calibrazione, in che modo ne devo tenere conto quando, dopo aver svolto l'esperimento n° 4 (effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione) mi viene richiesto di "determinare la quantità di p-nitrofenolo prodotto per minuto, nei 10 minuti di incubazione di ogni tubo"? Oppure ancora, quando dopo aver eseguito l'esperimento 3 mi viene richiesto di "preparare una tabella dei risultati, includento la quantità di p-nitrofenolo prodotto (usando la curva di calibrazione del p-nitrofenolo)"? O_o
Purtroppo questa materia è fatta solo di pratica e niente lezioni teoriche, quindi forse sarà scontato per chi ha studiato biochimica, ma non per me che sto seguendo questa materia in erasmus senza aver mai aperto un libro di biochimica  :-S vi ringrazio in anticipo per l'aiuto.  *Hail*
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Magari postare nel luogo giusto?
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[-] I seguenti utenti ringraziano Beefcotto87 per questo post:
Kokosekko
Posso rispondere o devo aspettare che l'utente posti la domanda nella sezione corretta?
Ciao
Luisa

Dal laboratorio se ne usciva ogni sera, e più acutamente a fine corso, con la sensazione di avere “imparato a fare una cosa”;
il che, la vita lo insegna, è diverso dall’avere “imparato una cosa”.
(Primo Levi)


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Il thread è nella sezione corretta perché Beef l'ha spostato asd
La tua firma è old e molto 2010... [cit. myttex]
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LuiCap
La fosfatasi alcalina (ALP) è un isoenzima, che, a pH alcalino, catalizza la reazione di idrolisi dell'p-nitrofenilfosfato (p-NPP) secondo la seguente reazione:
   
Il p-NPP è incolore a qualsiasi valore di pH, mentre il p-nitrofenolo (debole acido organico) è incolore a pH<5,6 e giallo a pH>7,6.
Perciò, preparando soluzioni a diversa concentrazione di p-nitrofenolo in ambiente tamponato leggermente basico, l'intensità del colore giallo delle soluzioni è direttamente proporzionale all'Assorbanza; riportando in grafico i valori di Assorbanza (in ordinata) in funzione della concentrazione delle soluzioni di p-nitrofenolo (in ascissa) si ottiene una retta denominata curva di taratura o di calibrazione.

Ogni volta che si va a determinare uno dei fattori che influenzano l'attività catalitica dell'ALP si va a misurare l'assorbanza delle soluzioni in cui si è prodotta una quantità variabile di p-nitrofenolo che viene determinata mediante la curva di taratura precedentemente costruita.

Determinazione dell'attività specifica: si preparano soluzioni a diversa concentrazione di enzima in soluzione tampone a pH leggermente basico, si addiziona ad ognuna la stessa quantità di substato in eccesso, si incuba ogni tubo per lo stesso tempo a temperatura costante, quindi si misura l'assorbanza di ogni soluzione che sarà proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si è formato. La quantità di p-nitrofenolo che si è formata in ogni tubo viene ricavata dalla curva di taratura precedentemente costruita. Si riportano in grafico le concentrazioni di p-nitrofenolo che si formano in 1 minuto in ordinata in funzione della concentrazione di enzima in ascisse: l'attività dell'enzima è la quantità di p-nitrofenolo che si forma in 1 minuto da 1 mg di enzima.

Effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione: si preparano soluzioni a diversa concentrazione di substato in soluzione tampone a pH leggermente basico, si addiziona ad ognuna la stessa quantità di enzima, si incuba ogni tubo per lo stesso tempo a temperatura costante, quindi si misura l'assorbanza di ogni soluzione che sarà proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si è formato. La quantità di p-nitrofenolo che si è formata in ogni tubo viene ricavata dalla curva di taratura precedentemente costruita. Si riportano in grafico le concentrazioni di p-nitrofenolo che si formano in 1 minuto in ordinata in funzione della concentrazione del substrato in ascisse.

Effetto del pH sulla velocità di reazione: si preparano soluzioni tampone a diverso pH, si addiziona ad ognuna la stessa quantità di enzima e la stessa quantità di substrato in eccesso, si incuba ogni tubo per lo stesso tempo a temperatura costante, quindi si misura l'assorbanza di ogni soluzione che sarà proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si è formato. La quantità di p-nitrofenolo che si è formata in ogni tubo viene ricavata dalla curva di taratura precedentemente costruita. Si riportano in grafico le concentrazioni di p-nitrofenolo che si formano in 1 minuto in ordinata in funzione del pH in ascisse.

Effetto della temperatura sulla velocità di reazione: si preparano soluzioni contenenti la stessa quantità di enzima e la stessa quantità di substrato in eccesso, si incuba ogni tubo per lo stesso tempo a diverse temperature, quindi si misura l'assorbanza di ogni soluzione che sarà proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si è formato. La quantità di p-nitrofenolo che si è formata in ogni tubo viene ricavata dalla curva di taratura precedentemente costruita. Si riportano in grafico le concentrazioni di p-nitrofenolo che si formano in 1 minuto in ordinata in funzione della temperatura in ascisse.
Ciao
Luisa

Dal laboratorio se ne usciva ogni sera, e più acutamente a fine corso, con la sensazione di avere “imparato a fare una cosa”;
il che, la vita lo insegna, è diverso dall’avere “imparato una cosa”.
(Primo Levi)


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Beefcotto87, NaClO, obliviate
Grazie mille. Quindi, è come se dovessi calcolare la quantità di p-nitrofenolo prodotto tenendo conto della curva e poi confrontarlo con quello prodotto in altre condizioni? In che modo si fa? Tipo sottraendo quello iniziale da quello finale?
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Non certo facendo la sottrazione che hai detto.

Se vuoi che ti faccia un esempio di calcoli, mi devi fornire dei dati sperimentali, il protocollo dettagliato che hai eseguito e ciò che ti viene richiesto.
Ciao
Luisa

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Ho 15 soluzioni dal volume totale di 2 mL ciascuna contenenti:
1) 2 mL di glycine buffer 0.05 M + 0.00 mL di p-nitrofenil fosfato in buffer 0.05 M pH9.5
2) 1.99 mL di glycine buffer 0.05 M + 0.01 mL di p-nitrofenil fosfato in buffer 0.05 M pH 9.5
3) 1.98 mL glycine buffer 0.05 M + 0.02 mL di p-nitrofenil fosfato in buffer 0.05 M pH 9.5
4) 1.96 + 0.04
5) 1.94 + 0.06
6) 1.92 + 0.08
7) 1.90 + 0.10
8) 1.85 + 0.15
9) 1.80 + 0.20
10) 1.60 + 0.40
11) 1.40 + 0.60
12) 1.20 + 0.80
13) 1.00 + 1.00
14) 0.50 + 1.50
15) 0.00 + 2.00
Dopo averli incubati per raggiungere 37°C, ho aggiunto 2 mL di fosfatasi alcalina 0.05 mg/mL in buffer 0.05 M a 37°C in ogni provetta a intervalli di 30 secondi. Le provette sono state incubate per 10 minuti e, cominciando dalla prima sempre a intervalli di 30 secondi, ho aggiunto 4 ml di buffer a pH 11.2 per fermare la reazione a un pH alcalino. Infine ho misurato l'assorbanza che ha qeusti valori:
1) 0
2) 0.069
3) 0.139
4) 0.275
5) 0.417
6) 0.553
7) 0.662
8) 1.079
9) 1.289
10) 2.347
11) 3.585
12) 4.165
13) 4.715
14) 6.095
15) 6.860
Quello che devo fare è calcolare la quantità di p-nitrofenolo prodotto per minuto nei 10 minuti di incubazione usando la curva di calibrazione precedentemente costruita. La curva di calibrazione che ho costruito la allego come immagine, spero sia corretta. I valori di assorbanza della curva del giorno in cui ho ottenuto i risultati scritti qui sopra sono quelli della 6 settimana.
grazie in anticipo se può aiutarmi *Hail*
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Mi dovresti fornire anche i dati con i quali hai costruito la curva di titolazione.
Grazie.
Ciao
Luisa

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ecco qui


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