Acidi nucleici

1. Introduzione

Il primo isolamento di quello che ora noi sappiamo essere il DNA fu portato a termine da Johann Friedrich Miescher circa nel 1870. Riportò la scoperta di una sostanza debolmente acida di funzione ignota nel nucleo dei globuli bianchi nel sangue, e chiamò questo materiale "nucleina". Pochi anni più tardi, Miescher separò la nucleina nei componenti proteina ed acido nucleico. Negli anni '20 gli acidi nucleici vennero scoperti essere i componenti maggioritari dei cromosomi, piccoli corpi recanti geni, nei nuclei di cellule complesse. L'analisi elementale degli acidi nucleici mostrò la presenza di fosforo, oltre ai soliti C, H, N & O. Diversamente dalle proteine, gli acidi nucleici non contengono zolfo. L'idrolisi completa degli acidi nucleici cromosomiali dava fosfato inorganico, 2-deossiribosio (un zucchero fino ad allora ignoto) e quattro differenti basi eterocicliche (mostrate nello schema sotto). Per evidenziale l'insolita componente 2-deossiribosio, gli acidi nucleici cromosomiali sono chiamati acidi deossiribonucleici, abbreviato DNA. Gli analoghi acidi nucleici in cui la componente zucchero è il ribosio sono chiamati acidi ribonucleici, abbreviato RNA. Il carattere acido degli acidi nucleici venne attribuito alla metà acido fosforico.

Le due basi monocicliche mostrate qui sono classificate come pirimidine, e le due basi bicicliche sono purine. Ognuna ha almeno un sito N-H a cui può essere attaccato un sostituente organico. Esse sono tutte basi polifunzionali, e possono esistere in forme tautomeriche.

L'idrolisi base catalizzata del DNA ha portato quali prodotti a quattro nucleosidi, che si sono dimostrati essere N-glicosidi del 2'-deossiribosio combinati con le amine eterocicliche. Le strutture ed i nomi di questi nucleosidi sono mostrati sotto.

Le basi che compongono tali nucleosidi sono colorate in verde, e lo zucchero è nero. Come notato nella struttura della 2'-deossicitidina sulla sinistra, la numerazione dei carboni dello zucchero fa uso dei numeri adatti per distinguerli dai siti delle base eterociclica. I corrispondenti N-glicosidi del comune zucchero ribosio sono i building blocks dell'RNA, e sono chiamati adenosina, citidina, guanosina ed uridina (un analogo della timidina cui manca il gruppo metile).

Da questa prova, gli acidi nucleici possono essere formulati come copolimeri che si alternano di acido fosforico (P) e nucleosidi (N), come mostrato:

~ P – N – P – N'– P – N''– P – N'''– P – N ~

All'inizio i quattro nucleosidi, distinti dagli apici in questra formula grezza, vennero assunti essere presenti in uguali quantità, come si risultava dalla struttura uniforme, come quella dell'amido. Comunque, un composto di questo tipo, presumibilmente comune a tutti gli organismi, fu considerato troppo semplice per possedere l'informazione ereditaria che risiede nei cromosomi. Questo punto di vista fu messo alla prova nel 1944, quando Oswald Avery e colleghi dimostrarono che il DNA batterico era probabilmente l'agente genetico che portava l'informazione da un organismo all'altro in un processo chiamato "trasformazione". Egli concluse che "gli acidi nucleici devono essere considerati possedere specificità biologica, la cui base chimica è finora indeterminata." Nonostante questa scoperta, molti scienziati continuarono a credere che le proteine cromosomiali, che sono diverse tra le specie, tra gli individui, ed anche all'interno di dati organismi, erano il luogo dell'informazione genetica di un organismo.

Dovrebbe essere notato che gli organismi unicellulari come i batteri non hanno un nucleo ben definito. Invece, il loro unico cromosoma è associato a proteine specifiche in una regione chiamata "nucleoide". Nonostante ciò, il DNA dai batteri ha la stessa composizione e la stessa struttura generale come quella degli organismi pluricellulari, inclusi gli esseri umani.

I punti di vista circa il ruolo del DNA nell'eridarietà cambiarono verso la fine degli anni '40 e gli inizi degli anni '50. Conducendo un'attenta analisi del DNA da molte fonti, Erwin Chargaff trovò che la sua composizione era specifica per una data specie. Inoltre, scoprì che la quantità di adenina (A) uguagliava sempre la quantità di timina (T), e che la quantità di guanina (G) uguagliava sempre la quantità di citosina (C), a prescindere dalla fonte del DNA. Il rapporto (A+T)/(C+G) variava da 2.70 a 0.35. Gli ultimi due organismi sono batteri.

Distribuzione delle basi nucleosidiche nel DNA

Organismo - Composizione delle basi A G T C (mole %) - Rapporti tra le basi A/T G/C - Rapporto (A+T)/(G+C)

Umano 30.9 19.9 29.4 19.8 1.05 1.00 1.52

Pollo 28.8 20.5 29.2 21.5 1.02 0.95 1.38

Lievito 31.3 18.7 32.9 17.1 0.95 1.09 1.79

Clostridium perfringens 36.9 14.0 36.3 12.8 1.01 1.09 2.70

Sarcina lutea 13.4 37.1 12.4 37.1 1.08 1.00 0.35

In un secondo studio critico, Alfred Hershey e Martha Chase mostrarono che quando un batterio viene infettato e geneticamente trasformato da un virus, almeno l'80% del DNA virale entra nella cellula batterica ed almeno l'80% della proteina virale rimane fuori. Assieme alle scoperte di Chargaff questo lavoro stabilì che il DNA è il depositario delle caratteristiche uniche, genetiche di un organismo.

2. La natura chimica del DNA

La struttura polimerica del DNA può essere descritta in termini di unità monomeriche di complessità crescente. Nel riquadro ombreggiato in alto della seguente illustrazione, i tre componenti relativamente semplici menzionati prima sono mostrati. Sotto quello sulla sinistra, sono disegnate le formule dell'acido fosforico e di un nucleoside. La polimerizzazione per condensazione di questi porta alla formulazione del DNA evidenziata sopra. Infine, un estere 5'- monofosfato, chiamato nucleotide può essere disegnato come unità monomera singola, mostrata nel riquadro ombreggiato sulla destra. Dato che un estere monofosfato di questo genere è un acido forte (pK_a di 1.0), sarà completamente ionizzato al solito pH fisiologico (ca.7.4). I nomi per questi componenti del DNA sono riportati qui sotto.

Base - Nucleoside - 5'-Nucleotide

Adenina 2'-Deossiadenosina 2'-Deossiadenosina-5'-monofosfato

Citosina 2'-Deossicitidina 2'-Deossicitidina-5'-monofosfato

Guanina 2'-Deossiguanosina 2'-Deossiguanosina-5'-monofosfato

Timina 2'-Deossitimidina 2'-Deossitimidina-5'-monofosfato

Sono anche noti nucleotidi isomerici 3'-monofosfato, ed entrambi gli isomeri sono ritrovati nelle cellule. Essi possono essere ottenuti tramite idrolisi selettiva del DNA attraverso l'azione degli enzimi nucleasi. I nucleotidi simil anidride di- e trifosfato sono stati identificati come importanti trasportatori di energia nelle reazioni biochimiche, essendo il più comune l'ATP (adenosina 5'-trifosfato).

Una rappresentazione strutturale completa di un segmento del polimero DNA formato da 5'-nucleotidi è mostrato nel diagramma sotto.

Diverse importanti caratteristiche di questa formula dovrebbero essere notate.

• Primo, la rimanente funzione P-OH è completamente acida ed è completamente ionizzata in sistemi biologici.

• Secondo, la catena polimerica è strutturalmente diretta. Una estremità (5' è diversa dall'altra (3'.

• Terzo, sebbene il DNA sembri essere un polimero relativamente semplice, le permutazioni possibili di questi quattro nucleosidi nella catena diventano molto grandi all'allungarsi della catena.

• Quarto, il polimero di DNA è molto più grande di quanto creduto agli inizi. I pesi molecolari per il DNA da organismi pluricellulari sono comunemente di 10⁹ o di più.

L'informazione è immagazzinata o codificata nel polimero di DNA tramite lo schema in cui i quattro nucleotidi sono disposti. Per accedere a questa informazione lo schema deve essere "letto" in un modo lineare. Poiché gli organismi viventi sono estremamente complessi, una quantità proporzionalmente grande di informazione correlata a questa complessita deve essere immagazzinata nel DNA. Di conseguenza, il DNA stesso deve essere davvero grande, come notato sopra. Anche la singola molecola di DNA dal batterio E. coli si è scoperto avere circa un milione di unità nucleotidiche in un filamento di polimero, e dovrebbe raggiungere un millimetro in lunghezza se allungato. I nuclei degli organismi pluricellulari incorporano i cromosomi, che sono composti dal DNA combinato con le proteine nucleari chiamate istoni. Il moscerino della frutta ha 8 cromosomi, gli umani ne hanno 46 e i cani 78 (notate che la quantità di DNA in un nucleo cellulare non è correlato al numero dei cromosomi). Il DNA dal più piccolo cromosoma umano è grande più di dieci volte del DNA dell'E. coli, ed è stato stimato che il DNA totale in un umano dovrebbe estendersi per 2 metri in lunghezza se disfatto. Dato che il nucleo ha un diametro di solo circa 5 μm, il DNA cromosomiale deve essere impaccato stretto per occupare questo piccolo volume.

In aggiunta al suo ruolo come libreria stabile di informazioni, il DNA cromosomiale deve essere strutturato o organizzato in un modo tale che la macchina chimica della cellula avrà libero accesso a quella informazione, al fine di fare molecole importanti come i polipeptidi. Inoltre, copie accurate del codice del DNA devono essere create nel momento in cui la cellula si divide, con le molecole di DNA replicato passate alle generazioni cellulari seguenti, così come alla progenie dell'organismo. La natura di questa organizzazione del DNA, verrà discussa a breve.

3. RNA, un acido nucleico differente

L'acido nucleico ad elevato peso molecolare, il DNA, è ritrovato principalmente nei nuclei di cellule complesse, note come cellule eucariote, o nelle regioni del nucleoide di cellule procariote, come i batteri. È spesso associato a proteine che aiutano ad impaccarlo in maniera utilizzabile.

Invece, un acido nucleico a minore peso molecolare, ma molto più abbondante, l'RNA, è distribuito in tutta la cellula, più comunemente nei piccoli e numero organelli chiamati ribosomi. Tre tipi di RNA vengono identificati, e il sottogruppo più vasto (85-90%) è quello dell'RNA ribosomiale, rRNA, il componente maggioritario dei ribosomi, assieme alle proteine. La dimensione delle molecole di rRNA varia, ma è generalmente minore un migliaio di volte rispetto alla dimensione del DNA. Le altre forme di RNA sono l'RNA messaggero, mRNA, e l'RNA transfer, tRNA. Entrambi hanno una esistenza più transiente e sono più piccoli dell'rRNA.

Tutti questi RNA hanno costituzione simile, e differiscono dal DNA in due importanti aspetti. Come mostrato nello schema sotto, la componente zucchero dell'RNA è il ribosio, e la base pirimidinica uracile sostituisce la base timina del DNA. L'RNA gioca un ruolo vitale nel trasferimento dell'informazione (trascrizione) dalla libreria del DNA ai fattori proteici chiamati ribosomi, e nell'interpretazione di quella informazione (traslazione) per la sintesi di polipeptidi specifici. Queste funzioni verranno discusse dopo.

Sotto è riportata una completa rappresentazione strutturale di un segmento del polimero RNA formato da 5'-nucleotidi.

4. La struttura secondaria del DNA

Agli inizi degli anni '50 la struttura primaria del DNA fu ben definita, ma fu mancante una comprensione solida della sua struttura secondaria. Inoltre, la situazione fu simile a quella occupata dalle proteine un decennio prima, prima che l'alfa elica e i foglietti beta venissero proposti da Linus Pauling. Molti ricercatori furono alle prese con questo problema, e fu generalmente riconosciuto che le equivalenze molari delle coppie di basi (A & T e C & G) scoperte da Chargaff dovevano essere un fattore importante.

Rosalind Franklin, che lavorava al King's College di Londra, ottenne una prova tramite diffrazione a raggi X che suggeriva una lunga struttura ad elica di spessore uniforme. Francis Crick e James Watson, alla Cambridge University, considerarono le interazioni tramite ponti idrogeno tra le basi che si accoppiano, ed arrivarono ad un modello a doppia elica intrecciato che soddisfaceva dal maggior parte dei fatti noti, ed è stato confermato dalle scoperte successive.

Base Pairing

Un attento esame delle componenti base puriniche e pirimidiniche dei nucloetidi rivela che tre di esse potrebbero esistere come idrossi pirimidine o purine tautomere, aventi un anello eterociclico aromatico. Nonostante la stabilizzazione ulteriore di un anello aromatico, questi composti preferiscono adottare strutture tipo ammide. Queste opzioni sono mostrate nel seguente schema, con il tautomero più stabile disegnato in blu.

Un semplice modello per questo tautomerismo è fornito dalla 2-idrossipiridina. Come mostrato sotto a sinistra, un composto avente questa struttura ci si dovrebbe aspettare abbia caratteristiche tipo fenolo, come un gruppo idrossile acido. Comunque, il b.p. della sostanza vera e propria è di 100 °C superiore a quello del fenolo e la sua acidità è 100 volte minore di quella prevista (pK_a = 11.7). Queste differenze sono d'accordo con il tautomero 2-piridone, la forma stabile del sale interno zwitterionico.

Una prova ulteriore a supporto di questa attribuzione è mostrata sotto.

Notate che questo tautomerismo inverte il comportamento del legame ad idrogeno delle funzioni azoto ed ossigeno (il gruppo N-H del piridone diventa un donatore di legame ad idrogeno e l'ossigeno carbonilico un accettore).

La prova ulteriore per il tautomero piridone, che è mostrata sopra nello schema, consiste di assorbimenti IR e chemical shifts del ¹³C-NMR associati alla caratteristica del gruppo ammide. I dati per il 2-piridone sono sulla sinistra. Dati simili per il derivato N-metile, che non può tautomerizzare a derivati piridinico, sono presentati sulla destra.

Non appena essi ebbero identificato le basi tautomere preferite nei nucleosidi, Watson e Crick furono in grado di proporre un accoppiamento complementare, tramite legami ad idrogeno, della guanosina (G) con la citidina (C) e della adenosina (A) con la timidina (T). Questo accoppiamento, che è mostrato nello schema seguente, spiegava le scoperte di Chargaff stupendamente, e li condusse a proporre una struttura a doppia elica per il DNA.

Prima di osservare questa stessa struttura a doppia elica, è istruttivo esaminare le interazioni di accoppiamento tra basi in maggiore dettaglio. L'associazione G#C coinvolge tre legami ad idrogeno (colorati in rosa), ed è quindi più forte dell'associazione che coinvolte due legami ad idrogeno A#T. Questi accoppiamenti tra basi potrebbero apparire essere arbitrari, ma altre possibilità soffrirebbero di interazioni destabilizzanti steriche o elettroniche.

Sotto sono mostrati altri due di tali accoppiamenti. L'accoppiamento C#T sulla sinistra soffre della repulsione del dipolo del carbonile, così come dell'affollamento sterico degli ossigeni. L'accoppiamento G#A sulla destra è anch'esso destabilizzato dall'affollamento sterico (idrogeni cerchiati).

Un semplice strumento mnemonico per ricordare quali basi sono accoppiate deriva dalle linee usate per collegare le lettere maiuscole usate per identificare le basi. A e T sono messe assieme da linee dritte intersecanti. Invece, C e G sono in gran parte composte da linee curve. La base dell'RNA uracile corrisponde alla timina, dato che la U segue la T nell'alfabeto.