Aminoacidi peptidi e proteine
1. Introduzione

Le proteine, dal greco proteios, che significa primo, sono una classe di composti organici che sono presenti nelle cellule viventi e sono vitali per ognuna di esse. Sotto forma di pelle, capelli, callo, cartilagine, muscoli, tendini e legamenti, le proteine tengono assieme. proteggono, e forniscono una struttura al corpo di un organismo pluricellulare. Sotto forma di enzimi, ormoni, anticorpi, e globuline, essie catalizzano, regolano, e proteggono la chimica del corpo. Sotto forma di emoglobina, mioglobina e diverse lipoproteine, esse effettuano il trasporto di ossigeno e di altre sostanze all'interno dell'organismo.

Le proteine sono generalmente considerate benefiche, e sono una parte necessaria della dieta di tutti gli animali. Gli umani possono diventare gravemente ammalati se non mangiango abbastanza proteine idonee, una malattia nota come kwashiorkor, una forma estrema di carenza proteica. Gli antibiotici ed i vaccini basati sulle proteine aiutano a combattere la malattia, e noi scaldiamo e proteggiamo i nostri corpi cn vestiti e scarpe che spesso sono proteine in natura (lana, seta e cuoio).
Le proprietà mortali di tossine e veleni proteici è meno diffusamente apprezzata. La tossina botulinica di tipo A, dal Clostridium botulinum, è considerata come il più potente veleno conosciuto. Basandoci su studi tossicologici, un cucchiaino da tea di questa tossina dovrebbe essere sufficiente ad uccidere 1/5 edella popolazione mondiale. Le tossine prodotte dai microorganismi Clostridium tetani e Corynebacterium diphtheriae sono quasi velenosi come il citato Clostridium botulinum. Una lista di proteine o peptidi altamente tossici dovrebbe anche includere il veleno di molti serpenti, ed la ricina, la proteina tossica ritrovata nei semi del Ricinus communis.

Nonostante la varietà della loro funzione fisiologica e le differenze in proprietà fisiche — la seta è una fibra flessibile, il corno è un solido abbastanza rigido, e l'enzima pepsina cristalli solubili in acqua — le proteina sono sufficientemente simili nella struttura molecolare per assicurare il trattamento di esse come una unica famiglia chimica. Quando comparate ai carboidrati ed ai lipidi, le proteine sono ovviamente differenti nella composizione fondamentale. I lipidi sono per lo più idrocarburi in natura, essendo generalmente composti dal 75 all'85% di carbonio. I carboidrati sono circa al 50% costituiti da ossigeno, e come i lipidi, di solito hanno meno del 5% di azoto (spesso neanche questo). Le proteine ed i peptidi, dall'altro lato, sono composti dal 15 al 25% di azoto e circa dalla medesima quantità di ossigeno. La distinzione tra proteine e peptidi è la loro dimensione. I peptidi sono in un certo senso piccole proteina, avendo pesi molecolari inferiori a 10000.

2. α-Aminoacidi naturali

L'idrolisi delle proteine tramite acido o base acquosa ad ebollizione porta ad un assortimento di piccole molecole identificate come acidi α-aminocarbossilici. Più di venti di tali componenti sono stati isolati, e i più comuni di questi sono elencati nella tabella sotto. Quegli aminoacidi aventi nomi colorati in verde sono componenti essenziali della dieta, dato che essi NON sono sintetizzati tramite processi metabolici umani. La migliore fonte alimentare di questi nutrienti è la proteina, ma è importante riconoscere che non tutte le proteina hanno un uguale valore nutrizionale.
Per esempio, le arachidi hanno un contenuto in peso di proteina maggiore del pesce o delle uova, ma la proporzione di amino acidi essenziale nella parte proteica delle arachidi è solo 1/3 di quella derivata dalle due altre fonti. Per ragioni che diventaranno evidenti quando parleremo della struttura delle proteine e dei peptidi, ad ogni aminoacido viene assegnato una abbreviazione di una o tre lettere.

[Immagine: aminacid.gif]

Alcune caratteristiche comuni di questi aminoacidi dovrebbero essere note. Con l'eccezione della prolina, essi sono tutti amine primarie; e con l'eccezione della glicina, sono tutti chirali. Le configurazioni degli aminoacidi chirali sono le stesse quando scritte con la formula di proiezione di Fischer, come nel disegno sotto, e questa era definita come la configurazione L da Fischer.

[Immagine: fischraa.gif]

Il sostituente R in questa struttura è il componente strutturale rimanente che varia da un aminoacido ad un altro, e nella prolina R è un catena a tre carboni che unisce l'azoto al carbonio α in un anello a cinque membri. Applicando la notazione di Cahn-Ingold-Prelog, tutti questi aminoacidi naturali chirali, con l'eccezione della cisteina, hanno una configurazione S.

Per i primi sette composti nella colonna di sinistra il sostituente R è un idrocarburo. Le ultime tre voci nella colonna di sinistra hanno gruppi funzionali idrossile, e i primi due aminoacidi nella colonna di destra incorporano gruppi tiolo e solfuro rispettivamente. Lisina ed arginina hanno funzioni aminiche basiche nelle loro catene laterali; istidina e triptofano hanno anelli eterociclici azotati meno basici come sostituenti. Infine, le catene laterali acidi carbossilici sono sostituenti sull'acido aspartico e glutamico, e gli ultimi due composti nella colonna di destra sono le loro ammidi corrispondenti.

Le formule per gli aminoacidi scritte sopra sono semplici rappresentazioni di legami covalenti basate su precedenti conoscenze di analoghi monofunzionali. Le formule sono infatti sbagliate. Questo è evidente dalla comparazione delle proprietà fisiche di alcuni composti: acido isobutirrico, acido lattico, 3-amino-2-butanolo ed alanina. Tutti e quattro i composti sono all'incirca della stessa dimensione, ed hanno tutti solubilità in acqua da moderata ad eccellente. I primi due sono semplici acidi carbossilici, ed il terzo un amino alcole. Tutti e tre i composti sono solubili in solventi organici (etere ad esempio) ed hanno m.p. relativamente bassi. Gli acidi carbossilici hanno pKa vicine a 4.5, e l'acido coniugato dell'amina ha una pKa di 10. Il semplice aminoacido alanina è l'ultimo esempio. Per contrasto, ha un elevato m.p. (con decomposizione), è insolubole in solventi organici, ed è un acido un milione di volte più debole degli acidi carbossilici ordinari.

Queste differenze tutte puntano alla formazione di un sale interno tramite transfer di protone dalla funzione carbossilica acida al gruppo amino basico. La risultante struttura ammonio carbossilato, comunemente nota come zwitterione, è supportata anche dalle caratteristiche spettroscopiche dell'alanina.

CH3CH(NH2)CO2H [Immagine: arroweq1.gif] CH3CH(NH3)+CO2

Come previsto dal suo carattere ionico, lo zwitterione alanina ha un elevato m.p., è insolubile in solventi non polari ed ha la forza acida di uno ione ammonio primario. Notate che nella lisina la funzione amina più lontana dal gruppo carbossile è più basica dell'amina α. Di conseguenza, la metà ammonio caricata positivamente formata all'estremità terminale della catena è attratta dal carbossilato negativo, col risultato che tale aminoacido assume una conformazione ad elica o spirale.

Dato che gli aminoacidi, così come i peptidi e le proteine, incorporano gruppi funzionali sia acidi che basici, la specie molecolare predominante presente in una soluzione acquosa dipenderà dal pH della soluzione. Allo scopo di determinare la natura delle specie molecolari e ioniche che sono presenti in soluzioni acquose a differenti pH, utilizziamo l'equazione di Henderson - Hasselbalch, scritta sotto. Qui, i pKa rappresentano l'acidità di una funzione specifica acido coniugato (HA). Quando il pH della soluzione eguaglia il pKa, le concentrazioni di HA ed A devono essere uguali (log 1 = 0).

[Immagine: hndhaseq.gif]

La curva di titolazione per l'alanina, mostrata sotto, dimostra questra relazione. Ad un pH < 2, sia la funzione carbossilato che la funzione amina sono protonate, così la molecola di alanina ha un netta carica positiva. Ad un pH > 10, l'amina esiste come base neutra ed il carbossile come sua base coniugata, così la molecola di alanina ha un netta carica negativa. A pH intermedi la concentrazione dello zwitterione aumenta, e ad un pH caratteristico, chiamato il punto isoelettrico (pI), le specie molecolari negativamente e positivamente cariche sono presenti in concentrazione eguale. Questo comportamente è generale per aminoacidi semplici (difunzionali). Partendo da uno stato completamente protonato, la variazione di pKa delle funzioni acide varia da 1.8 a 2.4 per il –CO2H, e da 8.8 a 9.7 for –NH3+. I punti isoelettrici variano da 5.5 a 6.2. Le curve di titolazione mostrano la neutralizzazione di questi acidi tramite basi aggiunte, ed il cambiamentodi pH durante la titolazione.

[Immagine: alatitr.gif]

Le curve di titolazione per molti altri aminoacidi possono essere esaminate cliccando sul link qui riportato The University of Virginia in Charlottesville.
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jobba, ClaudioG.
La distribuzione di specie cariche in un campione può essere mostrato sperimentalmente osservando il movimenti di molecole di soluto in un campo elettrico, usando la tecnica dell'elettroforesi. Per tali esperimenti una soluzione di un tampone ionico viene incorporata in uno strato di matrice solida, comporta da carta o sostanza tipo gelatina crosslinked. Una piccola quantità dell'aminoacido, del peptide o della proteina viene posta vicino al centro della striscia di matrice ed un potenziale elettrico viene applicati alle estremità di tale striscia, come mostrato nel disegno sotto, a sinistra. La struttura solida della matrice ritarda la diffusione delle molecole di soluto, che rimarranno dove sono state inserite, nonostante su di esse agisca un potenziale elettrostatico. Nell'esempio mostrato qui, quattro differenti aminoacidi (mostrati sotto a destra) vengono esaminati simultaneamente in un mezzo tamponato a pH 6.00.

[Immagine: elephor1.gif] [Immagine: aacids60.gif]

I risultati di questo esperimento sono mostrati nel disegno animato sotto. Notate che i colori usati per ogni aminoacido sono solo un modo conveniente per differenziarli, dato che questi aminoacidi sono incolori.

[Immagine: elecphor.gif]

A pH 6.00 l'alanina e la isoleucina esistono in media come molecole zwitterioniche neutre, e non sono influenzate dal campo elettrico. L'arginina è un amino acido basico. Entrambe le funzioni basiche esistono come acidi coniugati "onio" nella matrice a pH 6.00. Le molecole di soluto dell'arginina quindi portano un eccesso di carica positiva, e si muovono verso il catodo. Le due funzioni carbossile nell'acido aspartico sono entrambe ionizzata a pH 6.00, e le molecole di soluto negativamente cariche si muovono verso l'anodo nel campo elettrico. Le strutture per queste specie sono mostrare sopra, a destra.

Dovrebbe essere chiaro che il risultato di questo esperimento è dipendente in modo critico dal pH della matrice tampone. Se ripetessimo l'elettroforesi di questi composti ad un pH di 3.80, l'acido aspartico rimarrebbe nel suo punto di origine, e gli altri amino acidi si muoverebbe verso il catodo. Ignorando le differenze in dimensione e forma molecolare, l'arginina dovrebbe muoversi due volte più veloce dell'alanina e dell'isoleucina perché le sue molecole di soluto in media porterebbero il doppio della carica positiva.

Come notato in precedenza, le curve di titolazione di semplici aminoacidi mostrano due punti di flesso, uno a causa del gruppo carbossile fortemente acido (pKa1 = 1.8 - 2.4), e l'altro per la funzione meno acida ammonio (pKa2 = 8.8 - 9.7). Per l'aminoacido secondario prolina, la pKa2 è 10.6, che riflette la maggiore basicità delle amine secondarie.
Alcuni aminoacidi hanno funzioni acide o basiche addizionali nelle loro catene laterali.

[Immagine: asptitr.gif]

Il pH molto elevato richiesto per rimuovere l'ultimo protone acido dall'arginina riflette la basicità eccezionalmente alta della metà guanidina all'estremità della catena laterale (vedi sotto).

[Immagine: argtitr.gif]

3. Il punto isoelettrico

Come definito sopra, il punto isoelettrico, pI, è il pH di una soluzione acquosa di un aminoacido (o peptide) a cui le molecole in media non hanno una carica netta. In altre parole, i gruppi positivamente carichi sono esattamente bilanciati tramite gruppi carichi negativamente.
Per aminoacidi semplici come l'alanina, il pI è una media delle pKa dei gruppi carbossile (2.34) ed ammonio (9.69). Perciò, il pI per l'alanina è, facendo i calcoli, (2.34 + 9.69)/2 = 6.02, il valore determinato sperimentalmente. Se sono presenti gruppi addizionali acidi o basici come funzioni sulla catena laterale, il pI è la media delle pKa dei due acidi più simili. Per aiutare nella determinazione la similitudine definiamo due classi di acidi. La prima consiste di acidi che sono neutri nella loro forma protonata (CO2H & SH). La seconda include acidi che sono carichi positivamente nel loro stato protonato (NH3+). Nel caso dell'acido aspartico, gli acidi simili sono la funzione α-carbossile (pKa = 2.1) e la funzione carbossilica in catena laterale (pKa = 3.9), così il pI = (2.1 + 3.9)/2 = 3.0. Per l'arginina, gli acidi simili sono la specie guanidinio sulla catena laterale (pKa = 12.5) e la funzione α-ammonio (pKa = 9.0), così il pI calcolato = (12.5 + 9.0)/2 = 10.75.
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4. Altri aminoacidi naturali

I venti α-aminoacidi elencati sopra sono i componenti primari delle proteine, essendo il loro incorporamento governato dal codice genetico. Esistono molti altri aminoacidi che ricorrono naturalmente, e le strutture di alcuni di questi sono mostrate sotto. Alcuni, come l'idrossilisina e l'idrossiprolina, sono semplicemente derivati funzionalizzati di un composto descritto precedentemente. Questi due aminoacidi sono ritrovati nel collagene, una comune proteina strutturale. L'omoserina e l'omocisteina sono omologhi superiori dei loro omonomi. L'amino gruppo nella β-alanina è spostato verso l'estremità della catena a tre atomi di carbonio. È un componente dell'acido pantotenico, HOCH2C(CH3)2CH(OH)CONHCH2CH2CO2H, un membro del complesso della vitamina B ed un nutriente essenziale. L'acetil coenzima A è un derivato pirofosforilato dell'ammide dell'acido pantotenico. L'omologo γ-amino GABA è un neurotrasmettitore inibitore e un agente antiipertensivo.

[Immagine: aminacd2.gif]

Molti aminoacidi insoliti, tra cui gli entantiomeri D di alcuni acidi comuni, vengono prodotti dai microorganismi. Questi includono l'ornitina, che è un componente dell'antibiotico bacitracina A, e la statina, ritrovata come parte di un pentapeptide che inibisce l'azione dell'enzima digestivo pepsina.
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Mmmmm Allora mi sa che ti conviene parlare di tutti i derivati degli amminoacidi, se ci metti anche il GABA!
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Reazioni degli α-aminoacidi

1. Esterificazione dell'acido carbossilico

Gli aminoacidi subiscono la maggior parte delle reazioni chimiche caratteristiche di ogni funzione, assumendo il pH sia aggiustato ad un determinato valore. L'esterificazione dell'acido carbossilico è di solito condotta in condizione acide, come mostrato nelle due equazioni scritte sotto. In tali condizioni, le funzioni aminiche sono convertire nei loro sali di ammonio e gli acid carbossilici non sono dissociati. La prima equazione è una tipica esterificazione di Fischer che coinvolge il metanolo. Il prodotto iniziale è un sale di ammonio stabile. L'amino estere formato tramite neutralizzazione di questo sale è instabile, a causa dell'acilazione dell'amina da parte della funzione estere.
La seconda reazione illustra la benzilazione delle due funzioni carbossiliche dell'acido aspartico, usando l'acido p-toluenesolfonico come catalizzatore acido. Non appena la funzione carbossilica viene esterificata, le specie zwitterioniche non sono più possibili ed il prodotto si comporta come una qualsiasi amina primaria.

[Immagine: aa-ester.gif]

2. Acilazione dell'amina

Allo scopo di convertire la funzione aminica di un amicoacido in una ammide, il pH della soluzione deve essere alzato a 10 o di più così che le amine libere nucleofile siano presenti nel sistema di reazione. Gli acidi carbossilici sono tutti convertiti in anioni carbossilato ad un tale pH elevato, e non interferiscono con le reazioni di acilazione dell'amina. Le due reazioni seguenti sono illustrative. Nella prima, un cloruro acilico serve come agente acilante. Questo è un buon esempio di superiore nucleofilicità dell'azoto nelle reazioni di acilazione, dato che l'acqua e l'anione idrossido sono anche presenti come nucleofili competitivi. Una selettività simile che favorisce le amine è stata osservata nel test di Hinsberg. La seconda reazione utilizza un reagente tipo anidride per l'acilazione. Questa è una procedura particolarmente utile nella sintesi dei peptidi, grazie alla facilità con cui il gruppo t-butilcarbonile (t-BOC) può essere rimosso nell'ultimo passaggio. Dato che le ammidi sono solo debolmente basiche (pKa ~ -1), i risultanti derivati aminoacidi non mostrano carattere zwitterionico, e possono essere convertiti in una varietà di derivati degli acidi carbossilici.

[Immagine: aa-amide.gif]

3. Reazione con la ninidrina

Oltre a queste comuni reazioni delle amine e degli acidi carbossilici, i comuni α-aminoacidi, eccetto la prolina, subiscono una reazione unica con il trichetoidrindene idrato noto come ninidrina. Tra i prodotti di questa insolita reazione (mostrata sotto) c'è l'immino derivato colorato in viola, che fornisce un utile test colorimetrico per questi aminoacidi, la maggior parte dei quali sono incolori. Un'applicazione comune del test con ninidrina è la visualizzazione degli aminoacidi sulle lastrine della TLC. Come mostrato nel disegno animato sotto, campioni di aminoacidi o miscele di essi sono applicati lungo una linea nella parte bassa di una lastrina rettangolare per TLC (linea di base). Questa lastina viene immersa in un tampone acquoso, e questo liquido risale lentamente attraverso la lastrina fino all'estremità superiore. Non appena il fronte del solvente passa le gocce di campione depositate, i composti in ogni campione vengono trasportati verso l'alto ad una velocità che è caratteristica della loro funzionalità, dimensione ed interazione con la matrice della lastrina. Alcuni composti si muovono rapidamente verso l'alto, mentre alla fine altri possono muoversi poco o niente. Il rapporto tra la distanza percorsa da un composto dalla linea di base e la distanza del fronte del solvente dalla linea di base è definito come il fattore di ritardo (o ritenzione) Rf. Differenti aminoacidi di solito hanno differenti Rf in condizioni opportune. Nell'esempio animato, i tre composti campione (1, 2 & 3) hanno rispettivamente valori di Rf di 0.54, 0.36 & 0.78.

[Immagine: ninhydrx.gif]

[Immagine: paperchr.gif]

4. Coupling ossidativo

Il blando ossidante iodio reagisce selettivamente con alcuni gruppi delle catena laterale dell'aminoacido. Questi includono l'anello fenolico nella tirosina, e gli anelli eterociclici nel triptofano e nell'istidina, i quali tutti portano a prodotti di iodurazione elettrofila. Inoltre, i gruppi zolfo nella cisteina e nella metionina vengono anche essi ossidati dallo iodio. La misura quantitativa del consumo di iodio è stata usata per determinare il numero di tali residui nei peptidi. Le funzioni basiche nella lisina e nell'arginina sono cationi onio ad un pH < 8, e sono non reattive in quello stato.
La cisteina è un tiolo, e come la maggior parte dei tioli è dimerizzata ossidativamente a disolfuro, che è talvolta elencato com un aminoacido distinto sotto il nome di cistina. I legami disolfuro di questo tipo sono ritrovati in molti peptidi e proteine. Per esempio, le due catene peptidiche che costituiscono l'insulina sono tenute assieme da due ponti disolfuro. I nostri capelli sono costituiti da una proteina fibrosa chiamata cheratina, che contiene un insolitamente grossa porzione di cisteina. Quando ci si fa la permanente, i legami disolfuro vengono prima rotti e poi creati in questo trattamento. Il trattamento con iodio acquoso diluito ossida l'atomo di zolfo della metionina in un solfossido.

[Immagine: cyscys.gif]

(2011-12-15, 13:32)Beefcotto87 Ha scritto: Mmmmm Allora mi sa che ti conviene parlare di tutti i derivati degli amminoacidi, se ci metti anche il GABA!

Troppo sbattimento. Ho solo citato quelli sopra per far sapere che esistono. Magari più avanti metterò qualcosa. O se no lascio a te questo divertimento.
Ricordo che sono un chimico organico... E queste cose le ho viste sotto gli occhi della chimica organica in un corso da pochi crediti...
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Questo genere si biosintesi sono poco trattate anche nel mio corso :S Non saprei aggiungere più di quanto non sappia fare tu!
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Sintesi di α-aminoacidi

1) L'aminazione di acidi α-bromocarbossilici, illustrata dalla seguente equazione, fornisce un metodo semplice per la preparazione di acidi α-aminocarbossilici. I bromoacidi, a loro volta, sono preparati convenientemente dagli acidi carbossilici tramite reazione con Br2 + PCl3 (reazione di Hell-Volhardt-Zelinski). Sebbene questo approccio diretto abbia dato risultati mediocri quando usato per preparare semplici amine da alogenuri alchilici, è molto efficace per farsi gli aminoacidi, grazie alla ridotta nucleofilicità dell'atomo di azoto nel prodotto. Nonostante ciò, procedure più complesse che danno buone rese di composti puri vengono spesso scelte per la sintesi di aminoacidi.

[Immagine: aasynth1.gif]

2) Modificando l'azoto come sale della ftalimmide, la tendenza delle amine di subire sostituzioni multiple è eliminata, ed avviene una singola pulita reazione di sostituzione di alogenuri primari e di molti alogenuri secondari. Questa procedura, nota come sintesi di Gabriel, può essere usata per trarre vantaggio nell'aminazione degli esteri bromomalonici, come mostrato nell'equazione superiore del seguente schema. Dato che l'estere malonico sostituito con la ftalimmide ha un idrogeno acido (colorato in arancione), attivato da due gruppi estere, questo intermedio può essere convertito in un anione ambidentato ed alchilato. Infine, l'idrolisi base catalizzata della metà ftalimmide e degli esteri, seguita da acidificazione e decarbossilazione termica, produce un aminoacido e l'acido ftalico (non mostrato qui).

[Immagine: aasynth2.gif]

3) Un'elegante procedura, nota come sintesi di Strecker, assembla un α-aminoacid da ammoniaca (il precursore dell'amina), ione cianuro (il precursore del carbossile), ed un'aldeide. Questa reazione (mostrata sotto) è essenzialmente l'analogo imminico della formazione di una cianoidrina. L'α-amino nitrile formato in quetso modo può quindi essere idrolizzato in un aminoacido tramite catalisi acida o basica.

[Immagine: aasynth3.gif]

4) Risoluzione Le tre procedure descritte sopra, e molte altre che possono essere concepite, danno come prodotti degli aminoacidi racemi.
Se sono desiderati enantiomeri puri L o D, è necessario risolvere queste miscele racemiche. Un metodo comune di risoluzione dei racemi è tramite la formazione del sale diastereoisomerico con un acido o un base pura chirale. Questo viene illustrato per un aminoacido generico nel seguente schema. State attenti nel distinguere i simboli di carica, mostrati nei cerchi colorati, dai segni di rotazione ottica, mostrati tra parentesi!
Nel primo schema, sotto, la funzione acido carbossilico contribuisce alla formazione del sale diastereoisomerico. L'aminoacido racemo è prima convertito in una benzammide per rimuovere il carattere basico del gruppo amino. Poi, viene formato un sale di ammonio tramite combinazione dell'acido carbossilico con un'amina otticamente pura, come la brucina (correlata alla stricnina, anch'essa usata per risolvere acidi racemi). La struttura di questa amina non è mostrata, perché non è un fattore critico nella progressione logica dei passaggi. Dato che la metà aminoacido è racema e la base è un singolo enantiomero (levorotatorio in questo esempio), una miscela equimolare di sali diastereoisomerici viene formata (disegnata nel riquadro verde ombreggiato). I diastereoisomeri possono essere separati tramite cristallizzazione, cromatografia o un'altra manipolazione fisica, ed in questo modo uno degli isomeri può essere isolato per il trattamento successivo, in questa illustrazione è il diastereoisomero (+) : (−). Infine il sale viene rotto per trattamento acido, dando il (+)-aminoacido risolto assieme all'agente risolvente recuperato (l'amina otticamente attiva). Ovviamente, la stessa procedura può essere usata per ottenere l'enantiomero (−) dell'aminoacido.

[Immagine: resolve1.gif]

Dato che gli aminoacids sono anfoteri, la risoluzione ppotrebbe anche essere ottenuta sfruttando il carattere basico della funzione amino. Per questo approccio avremmo bisogno di un acido chirale enantiomericamente puro come l'acido tartarico per usarlo come agente risolvente.

[Immagine: resolve2.gif]

Nello schema sopra, questa strategia risolutiva alternativa viene illustrata. Notate che la funzione acido carbossilico è prima esterificata, così che essa non competerà con l'acido risolvente.
La risoluzione di derivati degli aminoacidi può anche essere ottenuta tramite discriminazione enzimatica nell'idrolisi di ammidi. Per esempio, un enzima aminoacilasi ricavato dai reni del maiale scinde un derivato ammidico di un L-aminoacido naturale più velocemente di quanto non accada con l'enantiomero D. Se la miscela racema di ammidi mostrate nel riquadro verde ombreggiato venisse trattata con questo enzima, l'enantiomero L (qualunque sia la sua rotazione) sarebbe rapidamente convertito nella sua forma zwitterionica libera, mentre l'enantiomero D rimarrebbe in larga parte immutato. Qui, le specie diastereoisomeriche sono stati di transizione più che intermedi isolabili. Questa separazione di enantiomeri, basata su velocità di reazione molto differenti, viene chiamata risoluzione cinetica.
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Peptidi & Proteine

1. Il legame peptidico

Se i gruppi funzionali amina ed acido carbossilico negli aminoacidi si uniscono assieme a formare legami ammidici, viene formata una catena di unità aminoacidiche, chiamata peptide. La struttura di un semplice tetrapeptide è mostrata nel seguente schema. Per convenzione, la componente dell'aminoacido che ritiene un gruppo amino libero è disegnata all'estremità sinistra (gruppo N-terminale) della catena del peptide, e la componente dell'aminoacido che ritiene un gruppo acido carbossilico libero è disegnata sulla destra (gruppo C-terminale). Come previsto, le funzioni libere amina ed acido carbossilico su una catena peptidica formano una struttura zwitterionica al loro pH isoelettrico.

[Immagine: peptide5.gif]

[Immagine: peptidgr.gif]

[Immagine: peptide6.gif]

La flessibilità conformazionale delle catene peptidiche è principalmente limitata dalle rotazioni attorno ai legami che portano gli atomi di carbonio α. Questa restrizione è a causa della natura rigida del legame ammidico (peptidico). Come mostrato nello schema seguente, la delocalizzazione della coppia elettronica dell'azoto nel gruppo carbonilico porta ad un significativo carattere di doppio legame tra il carbonio carbonilico e l'azoto. Questo mantiene i legami peptidici relativamente planari e resistenti al cambiamento conformazionale. I rettangolo ombreggiati nella struttura inferiore definiscono queste regioni, ed identificano le rotazioni relativamente facili che posso avvenire dove gli angoli si incontrano (cioè al carbonio α). Questo aspetto della struttura peptidica è un importante fattore che influenza le conformazioni adottate dalle proteina e dai grandi peptidi.

[Immagine: peptide7.gif]

2. La struttura primaria dei peptidi

Poiché la parte N-terminale di una catena peptidica è distinta da quella C-terminale, un piccolo peptide composta di diversi aminoacidi può avere diversi isomeri costituzionali. Per esempio, un dipeptide formato da due diversi aminoacidi può avere due strutture differenti. Perciò, l'acido aspartico (Asp) e la fenilalanina (Phe) possono essere combinati per produrre Asp-Phe o Phe-Asp, ricordando che l'aminoacido sualls sinistra è quello N-terminale. Il metil estere del primo dipeptide (struttura sotto) è il dolcificante artificiale aspartame, che è circa 200 volte più dolce del saccarosio.

[Immagine: aspartame.gif]

Nessuno degli aminoacidi componenti è dolce (Phe è in realtà amara), e i derivati dell'altro dipeptide (Phe-Asp) non sono dolci.
Un tripeptide composto di tre aminoacidi può essere costruito in 6 diversi modi (isomeri costituzionali), e il tetrapeptide mostrato sopra (composto di quattro diversi aminoacidi) dovrebbe avere 24 isomeri costituzionali. Quando tutti e venti gli aminoacidi naturali sono possibili componenti di un peptide, le combinazioni possibili sono enormi. La semplice probabilità statistica indica che il decapeptide formato da tutte le possibili combinazioni di questi aminoacidi dovrebbe totalizzare 2010 isomeri costituzionali!

I peptidi naturali di complessità variante sono abbondanti.
Il semplice e variamente distribuito tripeptide glutatione (prima voce nell'elenco sotto), è interessante perché la funzione carbossilica in catena laterale dell'acido glutamico N-terminale viene usato per il legame peptidico.
Un acido glutamico N-terminale può anche essere simile ad un lattame, come nel caso del TRH (seconda voce). L'abbreviazione per questa unità trasformata è pGlu (o pE), dove p sta per "piro" (tali chiusure d'anello avvengono spesso per riscaldamento).
I peptidi più grandi nell'elenco spesso dimostrano l'importanza delle abbreviazioni di aminoacidi usate, dato che una formula strutturale completa per un nonapeptide (o più grande) si dimostrebbe complessa ed inefficiente. Le formule che usano abbreviazioni letterali sono colorate in rosso.
I dieci peptidi elencati fanno uso di tutti e venti gli aminoacidi comuni. Notate che l'unità C-terminale ha la forma di una ammide in alcuni casi (TRH, angiotensina & ossitocina). Quando duo o più cisteine sono presenti nella catena peptidica, essono sono spesso unite tramite legami disolfuro (ossitocina & endotelina); e nel caso dell'insulina, due catene peptidiche separate (A & B) sono tenute assieme da tali connessioni.

Alcuni peptidi naturali comuni

• Glutatione (3 residui): si ritrova nella maggior parte delle cellule viventi, stimola la crescita dei tessuti; ha sequenza aminoacidica +H3NCH(CO2CH2CH2CONHCH(CH2SH)CONHCH2CO2H, γ-Glu-Cys-Gly (o γECG)

• TRH (3 residui): neuroormone ipotalamico, governa il rilascio di tirotropina

[Immagine: trh.gif]

• Angiotensina II (8 residui): agente in grado di aumentare la pressione sanguigna, agisce sulla ghiandola surrenale; ha sequenza aminoacidica Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-PheNH2 (o DRVYIHPFNH2)

• Bradichinina (9 residui): vasodilatatore ipotensivo, agisce sul muscolo liscio; ha sequenza aminoacidica: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg (o RPPGFSPFR)

• Ossitocina (9 residui): ormone che contrae l'utero, stimola anche la produzione di latte

[Immagine: oxytocin.gif]

• Somatostatina (14 residui): inibisce il rilascio dell'ormone della crescita, usata per il trattamento delle ulcere

[Immagine: somastat.gif]

• Endotelina (21 residui): potente vasocostrittore, strutturalmente simile ad alcuni veleni di serpenti

[Immagine: endothel.gif]

• Melittina (26 residui): veleno dell'ape domestica, usata per il trattamento dei reumatismi; ha sequenza aminoacidica: Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro~
~Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-GlnNH2 (o GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQNH2)

• Glucagone (29 residui): fattore iperglicemico, usato come anti-diabete; ha sequenza aminoacidica: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp~
~Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (o HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT)

• Insulina (51 residui): ormone pancreatico, usato nel trattamento dei diabeti

[Immagine: insulin.gif]

I diversi aminoacidi che formano un peptide o una proteina, e l'ordine in cui sono uniti assieme tramite legami peptidici è definito struttura primaria. Dagli esempi mostrati sopra, dovrebbe essere evidente che non compito banale determinare la struttura primaria di tali composti, anche di quelli di modeste dimensioni.
L'idrolisi completa di una proteina o di un peptide, seguita da analisi degli aminoacidi stabilisce la sua composizione grezza, ma non fornisce alcuna informazione circa la sequenza dei legami.

L'idrolisi parziale produrrà una miscela di peptidi più corti e di alcuni aminoacidi. Se le strutture primarie di questi frammenti sono note, è qualche volta possibile dedurre parte o tutta la struttura originale traendo vantaggio dai pezzi che si sovrappongono. Per esempio, se un eptapeptide era composto da tre glicine, due alanine, una leucina ed una valina, potrebbero essere scritte molte strutture primarie possibili. D'altra parte, se l'idrolisi parziale aveva portato a due frammenti di un tripeptide noto e a due frammenti di un dipeptide noto, come mostrato sotto, la semplice analisi delle unità che si sovrappongono identifica la struttura primaria originale.

[Immagine: overlap.gif]

Ovviamente, questo genere di determinazione della struttura è molto inefficiente ed inaffidabile. Primo, necessitiamo di sapere le strutture di tutti i frammenti che si sovrappongono. Secondo, i peptidi più grandi dovrebbero dare miscele complesse che dovrebbero essere separate ed esaminate meticolosamente per trovare pezzi adatti per la sovrapposizione. Dovrebbe essere notato, comunque, la moderna spettrometria di massa usa questa tecnica di sovrapossizione efficacemente. La differenza è che la scissione dei legami non è ottenuta tramite idrolisi, ed i computers velocizzano il processo comparando innumerevoli frammenti.
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3. Analisi del gruppo N-terminale

Negli anni durante i quali i chimici avevano studiato questi prodotti naturali importanti, molte tecniche erano state usate per investigare la loro struttura primaria o la sequenza aminoacidica. Inoltre, gli strumenti commerciali che automaticamente sequenziano peptidi e proteine sono ora disponibili. Alcune delle più importanti tecniche comunemente usate saranno descritte qui.
L'indentificazione delle unità N-terminale e C-terminale di aminoacidi di una catena peptidica fornisce un'informazione utile. L'analisi N-terminale è portata a termine tramite la degradazione di Edman, che è evidenziata nel seguente schema. Una funzione aminica libera, di solito in equilibrio con la specie zwitterionica, è necessaria per l'iniziale legame con il reagente fenile isotiocianato. I prodotti della degradazione di Edman sono un eterociclo tioidantoina che incorpora l'aminoacido N-terminale assieme ad un catena peptidica accorciata. Le funzioni aminiche su una catena laterale, come nella lisina, possono reagire con il reagente isotiocianato, ma non danno prodotti tioidantoinici.

[Immagine: edman1.gif]

Il reagente fenile isotiocianato attacca e rimuove l'unità aminoacidica N-terminale nella forma di un eterociclo tioidantoina sostituito. I derivati caratteristici di questo tipo di tutti gli aminoacidi sono stati fatti e catalogati, così l'identificazione dell'unità terminale è portata a termine facilmente per paragone.

[Immagine: edman2.gif]

Il gruppo amino terminale si addizione alla funzione reattiva isotiocianato a dare una tiourea sostituita. Questa metà è conformazionalmente mobile, e l'atomo di zolfo può avvicinarsi alla carbonile del carbossile di un aminoacido N-terminale.

[Immagine: edman3.gif]

HCl anidro protona l'atomo di ossigeno dell'ammide, attivandolo verso l'attacco nucleofilo tramite zolfo. Poi, un eterociclo tiazolinone che incorpora l'unità N-terminale viene scisso, lasciando indietro una catena peptidica più corta. Questo anello eterociclico è instabile e subisce riarrangiamento acido catalizzato a tioidantoina isomerica (nel riquadro verde ombreggiato).

Una vantaggio maggiore della procedura di Edman è che la catena peptidica rimanente non è ulteriormente degradata durante la reazione. Questo significa che l'analisi N-terminale può essere ripetuta diverse volte, fornendo quindi la sequenza dei primi tre-cinque aminoacidi nella catena. Uno svantaggio della procedura è che peptidi più grandi di 30-40 unità non danno risultati soddisfacenti.

4. Analisi del gruppo C-terminale

Chimica

L'analisi complementare C-terminale delle catene peptidiche può essere portata a termine chimicamente o enzimaticamente. L'analisi chimica è leggermente più complessa della procedura di Edman. Prima, i gruppi carbossilici in catena laterale e i gruppi idrossilici devono essere protetti come ammidi o esteri. Poi, il gruppo carbossile C-terminale viene attivato come anidride e fatto reagire con tiocianato. L'acile tiocianato risultante immediatamente ciclizza ad idantoina, e questa può essere scissa dalla catena peptidica in diversi modi, non descritti qui. A seconda della natura di questa scissione finale, la procedura può essere modificata per dare come prodotto un peptide acile tiocianato C-terminale che automaticamente riarrangia ad un tioidantoina che incorpora la penultima unità C-terminale. Quindi, analisi ripetute possono essere condotte in un modo molto simile a quello usato per la procedura di Edman.

[Immagine: c-term1.gif]

Enzimatica

La scissione enzimatica dell'aminoacido C-terminale tramite uno dei diversi enzimi carbossipeptidasi è un metodo di analisi veloce e conveniente. Poiché il peptide prodotto accorciato è anche soggetto alla scissione enzimatica, deve essere fatta molta attenzione per controllare le condizioni di reazione così che i prodotti delle scissioni successive siano correttamente monitate. Il seguente esempio illustra questa caratteristica. Un peptide avente una sequenza C-terminale: ~Gly-Ser-Leu è soggetto alla scissione tramite carbossipeptidasi, e gli aminoacidi liberati in questa reazione sono analizzati ad intervalli di tempo crescenti. Sotto sono mostrati i risultati di questo esperimento. La leucina è scissa per prima, la serina per seconda, e la glicina per terza, come dimostrato dalla analisi sequenziale. ovviamente, la quarta e le quintà unità saranno anche esse rilasciate al passare del tempo, ma questi prodotti non sono mostrati.

[Immagine: c-term1x.gif]

[Immagine: c-term.gif]
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5. Scissione selettiva di peptidi

Dato che l'analisi dei gruppi terminali di grossi peptidi e proteina è di lavore limitato, i metodi di scissione selettiva come macromolecole in frammenti peptidici più piccoli sono comunemente impiegati come un passaggio importante nella comprensione strutturale.

Il bromuro di cianogeno (BrCN) è un metodo chimico, ha una specificità per il lato carbossilico dell'aminoacido metionina.
La tripsina è un metodo enzimatico, ha una specificità per il lato carbossilico di aminoacidi basici (ad esempio Lys & Arg).
La chimotripsina è un metod enzimatico, ha una specificità per il lato carbossilico di aminoacidi arilici (ad esempio Phe, Tyr & Trp).

Tutte queste procedure scindono le catene peptidiche in posizioni designate, e al lato carbossilico di un dato aminoacido.
Un meccanismo plausibile per la scissione con bromuro di cianogeno è evidenziato sotto. Il lato C-terminale della metionina è ottenuto come un peptide più piccolo, che può essere esaminato con una qualsiasi delle tecniche precedenti. Il lato N-terminale è caratterizzato da un lattone dell'omoserina alla sua estremità C-terminale.

I meccanismi per queste reazioni enzimatiche non sono facilmente formulati come per quelle chimiche. Altre scissioni enzimatiche sono state sviluppate, ma le due elencate qui serviranno per illustrare la loro applicazione.

[Immagine: cnbr-clv.gif]

Un esempio di analisi della struttura primaria

Per vedere come queste procedure possono essere combinate per comprendere la struttura primaria di un peptide, consideriamo l'ormone MSH (Melanocyte Stimulating Hormone) isolato dai maiali. Questo ottadecapeptide (18 unità aminoacidiche) ha la composizione: Arg, Asp2, Glu2, Gly2, His, Lys2, Met, Phe, Pro3, Ser, Tyr2, ed è abbreviato come P18. Il seguente schema, che inizia con i risultati dell'analidi dell'unità terminale, illustra i passaggi logici che potevano essere usati per risolvere il problema strutturale.

[Immagine: peptprb1.gif]

a) La scissione con il bromuro di cianogeno porta a due frammenti peptidici, il più lungo dei quali ha tutte le unità sul lato C-terminale della metionina.

[Immagine: peptprb2.gif]

b) L'analisi N-terminale del frammento undecapeptidico, P11[/sub], colloca i tre aminoacidi a destra della metionina.

[Immagine: peptprb3.gif]

c) La scissione tramite l'enzima tripsina del P[sup]11[/sub] mostra la posizione dell'arginina singola, che è ritrovata come unità C-terminale del frammento tetrapeptidico. Una delle due lisine è nota essere vicino all'estremità C-terminale. L'altro deve essere parte di un peptide più piccolo dalla reazione con il bromuro di cianogeno.

[Immagine: peptprb4.gif]

d) Con solo quattro aminoacidi rimanenti da posizionare, la posizione della seconda tirosina può essere ricercata tramite scissione con l'enzima chimotripsina del P[sup]18 stesso. Vengono ottenuti quattro frammenti, e la struttura finale potrebbe essere risolta da questi soltanto. Comunque, l'analisi selettiva del gruppo terminale dei due pentapeptidi serve a posizionare la tirosina e la seconda prolina vicino alla glicina più a sinistra, così come ad identificare le unità su ogni lato della metionina. L'unico aminoacido rimanente, una prolina, è quindi posizionata nell'ultimo sito vacante (riquadro giallo).

[Immagine: peptprb5.gif]


6. Peptidi ciclici

Se la funzione carbossilica all'estremità C-terminale di un peptide forma un legame peptidico con il gruppo amino N-terminale si forma un peptide ciclico. Le funzioni carbossilato ed amino sulle catene laterali possono anche essere combinarsi a formare anelli. I peptidi ciclici sono più comunemente ritrovati nei microorganismi, e spesso incorporano alcuni aminoacidi D così come aminoacidi insoliti come l'ornitina (Orn).
Il decapeptide, usato come antibiotico, gramacidina S, prodotto tramite da un ceppo del Bacillus brevis, è un esempio di questa interessante classe di prodotti naturali. La struttura della gramicidina S è mostrata nel seguente schema. Gli aminoacidi atipici sono colorati. Quando si usa un notazione stenografica per le strutture cicliche, la linea superiore è scritta tramite un convenzione solita (N-gruppo sulla sinistra), ma le linee verticali ed inferiori devono essere aggiustate per andare bene con il legame. Le frecce su questi legami puntano nella direzione CO-N di ogni legame peptidico.

[Immagine: gramicid.gif]
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