Aminoacidi peptidi e proteine

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quimico

2011-12-15 09:28

1. Introduzione

Le proteine, dal greco proteios, che significa primo, sono una classe di composti organici che sono presenti nelle cellule viventi e sono vitali per ognuna di esse. Sotto forma di pelle, capelli, callo, cartilagine, muscoli, tendini e legamenti, le proteine tengono assieme. proteggono, e forniscono una struttura al corpo di un organismo pluricellulare. Sotto forma di enzimi, ormoni, anticorpi, e globuline, essie catalizzano, regolano, e proteggono la chimica del corpo. Sotto forma di emoglobina, mioglobina e diverse lipoproteine, esse effettuano il trasporto di ossigeno e di altre sostanze all'interno dell'organismo.

Le proteine sono generalmente considerate benefiche, e sono una parte necessaria della dieta di tutti gli animali. Gli umani possono diventare gravemente ammalati se non mangiango abbastanza proteine idonee, una malattia nota come kwashiorkor, una forma estrema di carenza proteica. Gli antibiotici ed i vaccini basati sulle proteine aiutano a combattere la malattia, e noi scaldiamo e proteggiamo i nostri corpi cn vestiti e scarpe che spesso sono proteine in natura (lana, seta e cuoio).

Le proprietà mortali di tossine e veleni proteici è meno diffusamente apprezzata. La tossina botulinica di tipo A, dal Clostridium botulinum, è considerata come il più potente veleno conosciuto. Basandoci su studi tossicologici, un cucchiaino da tea di questa tossina dovrebbe essere sufficiente ad uccidere 1/5 edella popolazione mondiale. Le tossine prodotte dai microorganismi Clostridium tetani e Corynebacterium diphtheriae sono quasi velenosi come il citato Clostridium botulinum. Una lista di proteine o peptidi altamente tossici dovrebbe anche includere il veleno di molti serpenti, ed la ricina, la proteina tossica ritrovata nei semi del Ricinus communis.

Nonostante la varietà della loro funzione fisiologica e le differenze in proprietà fisiche — la seta è una fibra flessibile, il corno è un solido abbastanza rigido, e l'enzima pepsina cristalli solubili in acqua — le proteina sono sufficientemente simili nella struttura molecolare per assicurare il trattamento di esse come una unica famiglia chimica. Quando comparate ai carboidrati ed ai lipidi, le proteine sono ovviamente differenti nella composizione fondamentale. I lipidi sono per lo più idrocarburi in natura, essendo generalmente composti dal 75 all'85% di carbonio. I carboidrati sono circa al 50% costituiti da ossigeno, e come i lipidi, di solito hanno meno del 5% di azoto (spesso neanche questo). Le proteine ed i peptidi, dall'altro lato, sono composti dal 15 al 25% di azoto e circa dalla medesima quantità di ossigeno. La distinzione tra proteine e peptidi è la loro dimensione. I peptidi sono in un certo senso piccole proteina, avendo pesi molecolari inferiori a 10000.

2. α-Aminoacidi naturali

L'idrolisi delle proteine tramite acido o base acquosa ad ebollizione porta ad un assortimento di piccole molecole identificate come acidi α-aminocarbossilici. Più di venti di tali componenti sono stati isolati, e i più comuni di questi sono elencati nella tabella sotto. Quegli aminoacidi aventi nomi colorati in verde sono componenti essenziali della dieta, dato che essi NON sono sintetizzati tramite processi metabolici umani. La migliore fonte alimentare di questi nutrienti è la proteina, ma è importante riconoscere che non tutte le proteina hanno un uguale valore nutrizionale.

Per esempio, le arachidi hanno un contenuto in peso di proteina maggiore del pesce o delle uova, ma la proporzione di amino acidi essenziale nella parte proteica delle arachidi è solo 1/3 di quella derivata dalle due altre fonti. Per ragioni che diventaranno evidenti quando parleremo della struttura delle proteine e dei peptidi, ad ogni aminoacido viene assegnato una abbreviazione di una o tre lettere.

Alcune caratteristiche comuni di questi aminoacidi dovrebbero essere note. Con l'eccezione della prolina, essi sono tutti amine primarie; e con l'eccezione della glicina, sono tutti chirali. Le configurazioni degli aminoacidi chirali sono le stesse quando scritte con la formula di proiezione di Fischer, come nel disegno sotto, e questa era definita come la configurazione L da Fischer.

Il sostituente R in questa struttura è il componente strutturale rimanente che varia da un aminoacido ad un altro, e nella prolina R è un catena a tre carboni che unisce l'azoto al carbonio α in un anello a cinque membri. Applicando la notazione di Cahn-Ingold-Prelog, tutti questi aminoacidi naturali chirali, con l'eccezione della cisteina, hanno una configurazione S.

Per i primi sette composti nella colonna di sinistra il sostituente R è un idrocarburo. Le ultime tre voci nella colonna di sinistra hanno gruppi funzionali idrossile, e i primi due aminoacidi nella colonna di destra incorporano gruppi tiolo e solfuro rispettivamente. Lisina ed arginina hanno funzioni aminiche basiche nelle loro catene laterali; istidina e triptofano hanno anelli eterociclici azotati meno basici come sostituenti. Infine, le catene laterali acidi carbossilici sono sostituenti sull'acido aspartico e glutamico, e gli ultimi due composti nella colonna di destra sono le loro ammidi corrispondenti.

Le formule per gli aminoacidi scritte sopra sono semplici rappresentazioni di legami covalenti basate su precedenti conoscenze di analoghi monofunzionali. Le formule sono infatti sbagliate. Questo è evidente dalla comparazione delle proprietà fisiche di alcuni composti: acido isobutirrico, acido lattico, 3-amino-2-butanolo ed alanina. Tutti e quattro i composti sono all'incirca della stessa dimensione, ed hanno tutti solubilità in acqua da moderata ad eccellente. I primi due sono semplici acidi carbossilici, ed il terzo un amino alcole. Tutti e tre i composti sono solubili in solventi organici (etere ad esempio) ed hanno m.p. relativamente bassi. Gli acidi carbossilici hanno pKa vicine a 4.5, e l'acido coniugato dell'amina ha una pKa di 10. Il semplice aminoacido alanina è l'ultimo esempio. Per contrasto, ha un elevato m.p. (con decomposizione), è insolubole in solventi organici, ed è un acido un milione di volte più debole degli acidi carbossilici ordinari.

Queste differenze tutte puntano alla formazione di un sale interno tramite transfer di protone dalla funzione carbossilica acida al gruppo amino basico. La risultante struttura ammonio carbossilato, comunemente nota come zwitterione, è supportata anche dalle caratteristiche spettroscopiche dell'alanina.

CH3CH(NH2)CO2H CH3CH(NH3)+CO2

Come previsto dal suo carattere ionico, lo zwitterione alanina ha un elevato m.p., è insolubile in solventi non polari ed ha la forza acida di uno ione ammonio primario. Notate che nella lisina la funzione amina più lontana dal gruppo carbossile è più basica dell'amina α. Di conseguenza, la metà ammonio caricata positivamente formata all'estremità terminale della catena è attratta dal carbossilato negativo, col risultato che tale aminoacido assume una conformazione ad elica o spirale.

Dato che gli aminoacidi, così come i peptidi e le proteine, incorporano gruppi funzionali sia acidi che basici, la specie molecolare predominante presente in una soluzione acquosa dipenderà dal pH della soluzione. Allo scopo di determinare la natura delle specie molecolari e ioniche che sono presenti in soluzioni acquose a differenti pH, utilizziamo l'equazione di Henderson - Hasselbalch, scritta sotto. Qui, i pKa rappresentano l'acidità di una funzione specifica acido coniugato (HA). Quando il pH della soluzione eguaglia il pKa, le concentrazioni di HA ed A devono essere uguali (log 1 = 0).

La curva di titolazione per l'alanina, mostrata sotto, dimostra questra relazione. Ad un pH < 2, sia la funzione carbossilato che la funzione amina sono protonate, così la molecola di alanina ha un netta carica positiva. Ad un pH > 10, l'amina esiste come base neutra ed il carbossile come sua base coniugata, così la molecola di alanina ha un netta carica negativa. A pH intermedi la concentrazione dello zwitterione aumenta, e ad un pH caratteristico, chiamato il punto isoelettrico (pI), le specie molecolari negativamente e positivamente cariche sono presenti in concentrazione eguale. Questo comportamente è generale per aminoacidi semplici (difunzionali). Partendo da uno stato completamente protonato, la variazione di pKa delle funzioni acide varia da 1.8 a 2.4 per il –CO2H, e da 8.8 a 9.7 for –NH3+. I punti isoelettrici variano da 5.5 a 6.2. Le curve di titolazione mostrano la neutralizzazione di questi acidi tramite basi aggiunte, ed il cambiamentodi pH durante la titolazione.

Le curve di titolazione per molti altri aminoacidi possono essere esaminate cliccando sul link qui riportato The University of Virginia in Charlottesville.

I seguenti utenti ringraziano quimico per questo messaggio: jobba, ClaudioG.

quimico

2011-12-15 11:15

La distribuzione di specie cariche in un campione può essere mostrato sperimentalmente osservando il movimenti di molecole di soluto in un campo elettrico, usando la tecnica dell'elettroforesi. Per tali esperimenti una soluzione di un tampone ionico viene incorporata in uno strato di matrice solida, comporta da carta o sostanza tipo gelatina crosslinked. Una piccola quantità dell'aminoacido, del peptide o della proteina viene posta vicino al centro della striscia di matrice ed un potenziale elettrico viene applicati alle estremità di tale striscia, come mostrato nel disegno sotto, a sinistra. La struttura solida della matrice ritarda la diffusione delle molecole di soluto, che rimarranno dove sono state inserite, nonostante su di esse agisca un potenziale elettrostatico. Nell'esempio mostrato qui, quattro differenti aminoacidi (mostrati sotto a destra) vengono esaminati simultaneamente in un mezzo tamponato a pH 6.00.

I risultati di questo esperimento sono mostrati nel disegno animato sotto. Notate che i colori usati per ogni aminoacido sono solo un modo conveniente per differenziarli, dato che questi aminoacidi sono incolori.

A pH 6.00 l'alanina e la isoleucina esistono in media come molecole zwitterioniche neutre, e non sono influenzate dal campo elettrico. L'arginina è un amino acido basico. Entrambe le funzioni basiche esistono come acidi coniugati "onio" nella matrice a pH 6.00. Le molecole di soluto dell'arginina quindi portano un eccesso di carica positiva, e si muovono verso il catodo. Le due funzioni carbossile nell'acido aspartico sono entrambe ionizzata a pH 6.00, e le molecole di soluto negativamente cariche si muovono verso l'anodo nel campo elettrico. Le strutture per queste specie sono mostrare sopra, a destra.

Dovrebbe essere chiaro che il risultato di questo esperimento è dipendente in modo critico dal pH della matrice tampone. Se ripetessimo l'elettroforesi di questi composti ad un pH di 3.80, l'acido aspartico rimarrebbe nel suo punto di origine, e gli altri amino acidi si muoverebbe verso il catodo. Ignorando le differenze in dimensione e forma molecolare, l'arginina dovrebbe muoversi due volte più veloce dell'alanina e dell'isoleucina perché le sue molecole di soluto in media porterebbero il doppio della carica positiva.

Come notato in precedenza, le curve di titolazione di semplici aminoacidi mostrano due punti di flesso, uno a causa del gruppo carbossile fortemente acido (pKa1 = 1.8 - 2.4), e l'altro per la funzione meno acida ammonio (pKa2 = 8.8 - 9.7). Per l'aminoacido secondario prolina, la pKa2 è 10.6, che riflette la maggiore basicità delle amine secondarie.

Alcuni aminoacidi hanno funzioni acide o basiche addizionali nelle loro catene laterali.

Il pH molto elevato richiesto per rimuovere l'ultimo protone acido dall'arginina riflette la basicità eccezionalmente alta della metà guanidina all'estremità della catena laterale (vedi sotto).

3. Il punto isoelettrico

Come definito sopra, il punto isoelettrico, pI, è il pH di una soluzione acquosa di un aminoacido (o peptide) a cui le molecole in media non hanno una carica netta. In altre parole, i gruppi positivamente carichi sono esattamente bilanciati tramite gruppi carichi negativamente.

Per aminoacidi semplici come l'alanina, il pI è una media delle pKa dei gruppi carbossile (2.34) ed ammonio (9.69). Perciò, il pI per l'alanina è, facendo i calcoli, (2.34 + 9.69)/2 = 6.02, il valore determinato sperimentalmente. Se sono presenti gruppi addizionali acidi o basici come funzioni sulla catena laterale, il pI è la media delle pKa dei due acidi più simili. Per aiutare nella determinazione la similitudine definiamo due classi di acidi. La prima consiste di acidi che sono neutri nella loro forma protonata (CO2H & SH). La seconda include acidi che sono carichi positivamente nel loro stato protonato (NH3+). Nel caso dell'acido aspartico, gli acidi simili sono la funzione α-carbossile (pKa = 2.1) e la funzione carbossilica in catena laterale (pKa = 3.9), così il pI = (2.1 + 3.9)/2 = 3.0. Per l'arginina, gli acidi simili sono la specie guanidinio sulla catena laterale (pKa = 12.5) e la funzione α-ammonio (pKa = 9.0), così il pI calcolato = (12.5 + 9.0)/2 = 10.75.

quimico

2011-12-15 12:29

4. Altri aminoacidi naturali

I venti α-aminoacidi elencati sopra sono i componenti primari delle proteine, essendo il loro incorporamento governato dal codice genetico. Esistono molti altri aminoacidi che ricorrono naturalmente, e le strutture di alcuni di questi sono mostrate sotto. Alcuni, come l'idrossilisina e l'idrossiprolina, sono semplicemente derivati funzionalizzati di un composto descritto precedentemente. Questi due aminoacidi sono ritrovati nel collagene, una comune proteina strutturale. L'omoserina e l'omocisteina sono omologhi superiori dei loro omonomi. L'amino gruppo nella β-alanina è spostato verso l'estremità della catena a tre atomi di carbonio. È un componente dell'acido pantotenico, HOCH2C(CH3)2CH(OH)CONHCH2CH2CO2H, un membro del complesso della vitamina B ed un nutriente essenziale. L'acetil coenzima A è un derivato pirofosforilato dell'ammide dell'acido pantotenico. L'omologo γ-amino GABA è un neurotrasmettitore inibitore e un agente antiipertensivo.

Molti aminoacidi insoliti, tra cui gli entantiomeri D di alcuni acidi comuni, vengono prodotti dai microorganismi. Questi includono l'ornitina, che è un componente dell'antibiotico bacitracina A, e la statina, ritrovata come parte di un pentapeptide che inibisce l'azione dell'enzima digestivo pepsina.

Beefcotto87

2011-12-15 12:32

Mmmmm Allora mi sa che ti conviene parlare di tutti i derivati degli amminoacidi, se ci metti anche il GABA!

quimico

2011-12-15 13:42

Reazioni degli α-aminoacidi

1. Esterificazione dell'acido carbossilico

Gli aminoacidi subiscono la maggior parte delle reazioni chimiche caratteristiche di ogni funzione, assumendo il pH sia aggiustato ad un determinato valore. L'esterificazione dell'acido carbossilico è di solito condotta in condizione acide, come mostrato nelle due equazioni scritte sotto. In tali condizioni, le funzioni aminiche sono convertire nei loro sali di ammonio e gli acid carbossilici non sono dissociati. La prima equazione è una tipica esterificazione di Fischer che coinvolge il metanolo. Il prodotto iniziale è un sale di ammonio stabile. L'amino estere formato tramite neutralizzazione di questo sale è instabile, a causa dell'acilazione dell'amina da parte della funzione estere.

La seconda reazione illustra la benzilazione delle due funzioni carbossiliche dell'acido aspartico, usando l'acido p-toluenesolfonico come catalizzatore acido. Non appena la funzione carbossilica viene esterificata, le specie zwitterioniche non sono più possibili ed il prodotto si comporta come una qualsiasi amina primaria.

2. Acilazione dell'amina

Allo scopo di convertire la funzione aminica di un amicoacido in una ammide, il pH della soluzione deve essere alzato a 10 o di più così che le amine libere nucleofile siano presenti nel sistema di reazione. Gli acidi carbossilici sono tutti convertiti in anioni carbossilato ad un tale pH elevato, e non interferiscono con le reazioni di acilazione dell'amina. Le due reazioni seguenti sono illustrative. Nella prima, un cloruro acilico serve come agente acilante. Questo è un buon esempio di superiore nucleofilicità dell'azoto nelle reazioni di acilazione, dato che l'acqua e l'anione idrossido sono anche presenti come nucleofili competitivi. Una selettività simile che favorisce le amine è stata osservata nel test di Hinsberg. La seconda reazione utilizza un reagente tipo anidride per l'acilazione. Questa è una procedura particolarmente utile nella sintesi dei peptidi, grazie alla facilità con cui il gruppo t-butilcarbonile (t-BOC) può essere rimosso nell'ultimo passaggio. Dato che le ammidi sono solo debolmente basiche (pKa ~ -1), i risultanti derivati aminoacidi non mostrano carattere zwitterionico, e possono essere convertiti in una varietà di derivati degli acidi carbossilici.

3. Reazione con la ninidrina

Oltre a queste comuni reazioni delle amine e degli acidi carbossilici, i comuni α-aminoacidi, eccetto la prolina, subiscono una reazione unica con il trichetoidrindene idrato noto come ninidrina. Tra i prodotti di questa insolita reazione (mostrata sotto) c'è l'immino derivato colorato in viola, che fornisce un utile test colorimetrico per questi aminoacidi, la maggior parte dei quali sono incolori. Un'applicazione comune del test con ninidrina è la visualizzazione degli aminoacidi sulle lastrine della TLC. Come mostrato nel disegno animato sotto, campioni di aminoacidi o miscele di essi sono applicati lungo una linea nella parte bassa di una lastrina rettangolare per TLC (linea di base). Questa lastina viene immersa in un tampone acquoso, e questo liquido risale lentamente attraverso la lastrina fino all'estremità superiore. Non appena il fronte del solvente passa le gocce di campione depositate, i composti in ogni campione vengono trasportati verso l'alto ad una velocità che è caratteristica della loro funzionalità, dimensione ed interazione con la matrice della lastrina. Alcuni composti si muovono rapidamente verso l'alto, mentre alla fine altri possono muoversi poco o niente. Il rapporto tra la distanza percorsa da un composto dalla linea di base e la distanza del fronte del solvente dalla linea di base è definito come il fattore di ritardo (o ritenzione) Rf. Differenti aminoacidi di solito hanno differenti Rf in condizioni opportune. Nell'esempio animato, i tre composti campione (1, 2 & 3) hanno rispettivamente valori di Rf di 0.54, 0.36 & 0.78.

4. Coupling ossidativo

Il blando ossidante iodio reagisce selettivamente con alcuni gruppi delle catena laterale dell'aminoacido. Questi includono l'anello fenolico nella tirosina, e gli anelli eterociclici nel triptofano e nell'istidina, i quali tutti portano a prodotti di iodurazione elettrofila. Inoltre, i gruppi zolfo nella cisteina e nella metionina vengono anche essi ossidati dallo iodio. La misura quantitativa del consumo di iodio è stata usata per determinare il numero di tali residui nei peptidi. Le funzioni basiche nella lisina e nell'arginina sono cationi onio ad un pH < 8, e sono non reattive in quello stato.

La cisteina è un tiolo, e come la maggior parte dei tioli è dimerizzata ossidativamente a disolfuro, che è talvolta elencato com un aminoacido distinto sotto il nome di cistina. I legami disolfuro di questo tipo sono ritrovati in molti peptidi e proteine. Per esempio, le due catene peptidiche che costituiscono l'insulina sono tenute assieme da due ponti disolfuro. I nostri capelli sono costituiti da una proteina fibrosa chiamata cheratina, che contiene un insolitamente grossa porzione di cisteina. Quando ci si fa la permanente, i legami disolfuro vengono prima rotti e poi creati in questo trattamento. Il trattamento con iodio acquoso diluito ossida l'atomo di zolfo della metionina in un solfossido.


Beefcotto87 ha scritto:

Mmmmm Allora mi sa che ti conviene parlare di tutti i derivati degli amminoacidi, se ci metti anche il GABA!

Troppo sbattimento. Ho solo citato quelli sopra per far sapere che esistono. Magari più avanti metterò qualcosa. O se no lascio a te questo divertimento.

Ricordo che sono un chimico organico... E queste cose le ho viste sotto gli occhi della chimica organica in un corso da pochi crediti...

Beefcotto87

2011-12-15 13:56

Questo genere si biosintesi sono poco trattate anche nel mio corso :S Non saprei aggiungere più di quanto non sappia fare tu!

quimico

2011-12-16 08:55

Sintesi di α-aminoacidi 1) L'aminazione di acidi α-bromocarbossilici, illustrata dalla seguente equazione, fornisce un metodo semplice per la preparazione di acidi α-aminocarbossilici. I bromoacidi, a loro volta, sono preparati convenientemente dagli acidi carbossilici tramite reazione con Br2 + PCl3 (reazione di Hell-Volhardt-Zelinski). Sebbene questo approccio diretto abbia dato risultati mediocri quando usato per preparare semplici amine da alogenuri alchilici, è molto efficace per farsi gli aminoacidi, grazie alla ridotta nucleofilicità dell'atomo di azoto nel prodotto. Nonostante ciò, procedure più complesse che danno buone rese di composti puri vengono spesso scelte per la sintesi di aminoacidi. 2) Modificando l'azoto come sale della ftalimmide, la tendenza delle amine di subire sostituzioni multiple è eliminata, ed avviene una singola pulita reazione di sostituzione di alogenuri primari e di molti alogenuri secondari. Questa procedura, nota come sintesi di Gabriel, può essere usata per trarre vantaggio nell'aminazione degli esteri bromomalonici, come mostrato nell'equazione superiore del seguente schema. Dato che l'estere malonico sostituito con la ftalimmide ha un idrogeno acido (colorato in arancione), attivato da due gruppi estere, questo intermedio può essere convertito in un anione ambidentato ed alchilato. Infine, l'idrolisi base catalizzata della metà ftalimmide e degli esteri, seguita da acidificazione e decarbossilazione termica, produce un aminoacido e l'acido ftalico (non mostrato qui). 3) Un'elegante procedura, nota come sintesi di Strecker, assembla un α-aminoacid da ammoniaca (il precursore dell'amina), ione cianuro (il precursore del carbossile), ed un'aldeide. Questa reazione (mostrata sotto) è essenzialmente l'analogo imminico della formazione di una cianoidrina. L'α-amino nitrile formato in quetso modo può quindi essere idrolizzato in un aminoacido tramite catalisi acida o basica. 4) Risoluzione Le tre procedure descritte sopra, e molte altre che possono essere concepite, danno come prodotti degli aminoacidi racemi. Se sono desiderati enantiomeri puri L o D, è necessario risolvere queste miscele racemiche. Un metodo comune di risoluzione dei racemi è tramite la formazione del sale diastereoisomerico con un acido o un base pura chirale. Questo viene illustrato per un aminoacido generico nel seguente schema. State attenti nel distinguere i simboli di carica, mostrati nei cerchi colorati, dai segni di rotazione ottica, mostrati tra parentesi! Nel primo schema, sotto, la funzione acido carbossilico contribuisce alla formazione del sale diastereoisomerico. L'aminoacido racemo è prima convertito in una benzammide per rimuovere il carattere basico del gruppo amino. Poi, viene formato un sale di ammonio tramite combinazione dell'acido carbossilico con un'amina otticamente pura, come la brucina (correlata alla stricnina, anch'essa usata per risolvere acidi racemi). La struttura di questa amina non è mostrata, perché non è un fattore critico nella progressione logica dei passaggi. Dato che la metà aminoacido è racema e la base è un singolo enantiomero (levorotatorio in questo esempio), una miscela equimolare di sali diastereoisomerici viene formata (disegnata nel riquadro verde ombreggiato). I diastereoisomeri possono essere separati tramite cristallizzazione, cromatografia o un'altra manipolazione fisica, ed in questo modo uno degli isomeri può essere isolato per il trattamento successivo, in questa illustrazione è il diastereoisomero (+) : (−). Infine il sale viene rotto per trattamento acido, dando il (+)-aminoacido risolto assieme all'agente risolvente recuperato (l'amina otticamente attiva). Ovviamente, la stessa procedura può essere usata per ottenere l'enantiomero (−) dell'aminoacido. Dato che gli aminoacids sono anfoteri, la risoluzione ppotrebbe anche essere ottenuta sfruttando il carattere basico della funzione amino. Per questo approccio avremmo bisogno di un acido chirale enantiomericamente puro come l'acido tartarico per usarlo come agente risolvente. Nello schema sopra, questa strategia risolutiva alternativa viene illustrata. Notate che la funzione acido carbossilico è prima esterificata, così che essa non competerà con l'acido risolvente. La risoluzione di derivati degli aminoacidi può anche essere ottenuta tramite discriminazione enzimatica nell'idrolisi di ammidi. Per esempio, un enzima aminoacilasi ricavato dai reni del maiale scinde un derivato ammidico di un L-aminoacido naturale più velocemente di quanto non accada con l'enantiomero D. Se la miscela racema di ammidi mostrate nel riquadro verde ombreggiato venisse trattata con questo enzima, l'enantiomero L (qualunque sia la sua rotazione) sarebbe rapidamente convertito nella sua forma zwitterionica libera, mentre l'enantiomero D rimarrebbe in larga parte immutato. Qui, le specie diastereoisomeriche sono stati di transizione più che intermedi isolabili. Questa separazione di enantiomeri, basata su velocità di reazione molto differenti, viene chiamata risoluzione cinetica.

quimico

2011-12-16 10:14

Peptidi & Proteine 1. Il legame peptidico Se i gruppi funzionali amina ed acido carbossilico negli aminoacidi si uniscono assieme a formare legami ammidici, viene formata una catena di unità aminoacidiche, chiamata peptide. La struttura di un semplice tetrapeptide è mostrata nel seguente schema. Per convenzione, la componente dell'aminoacido che ritiene un gruppo amino libero è disegnata all'estremità sinistra (gruppo N-terminale) della catena del peptide, e la componente dell'aminoacido che ritiene un gruppo acido carbossilico libero è disegnata sulla destra (gruppo C-terminale). Come previsto, le funzioni libere amina ed acido carbossilico su una catena peptidica formano una struttura zwitterionica al loro pH isoelettrico. La flessibilità conformazionale delle catene peptidiche è principalmente limitata dalle rotazioni attorno ai legami che portano gli atomi di carbonio α. Questa restrizione è a causa della natura rigida del legame ammidico (peptidico). Come mostrato nello schema seguente, la delocalizzazione della coppia elettronica dell'azoto nel gruppo carbonilico porta ad un significativo carattere di doppio legame tra il carbonio carbonilico e l'azoto. Questo mantiene i legami peptidici relativamente planari e resistenti al cambiamento conformazionale. I rettangolo ombreggiati nella struttura inferiore definiscono queste regioni, ed identificano le rotazioni relativamente facili che posso avvenire dove gli angoli si incontrano (cioè al carbonio α). Questo aspetto della struttura peptidica è un importante fattore che influenza le conformazioni adottate dalle proteina e dai grandi peptidi. 2. La struttura primaria dei peptidi Poiché la parte N-terminale di una catena peptidica è distinta da quella C-terminale, un piccolo peptide composta di diversi aminoacidi può avere diversi isomeri costituzionali. Per esempio, un dipeptide formato da due diversi aminoacidi può avere due strutture differenti. Perciò, l'acido aspartico (Asp) e la fenilalanina (Phe) possono essere combinati per produrre Asp-Phe o Phe-Asp, ricordando che l'aminoacido sualls sinistra è quello N-terminale. Il metil estere del primo dipeptide (struttura sotto) è il dolcificante artificiale aspartame, che è circa 200 volte più dolce del saccarosio. Nessuno degli aminoacidi componenti è dolce (Phe è in realtà amara), e i derivati dell'altro dipeptide (Phe-Asp) non sono dolci. Un tripeptide composto di tre aminoacidi può essere costruito in 6 diversi modi (isomeri costituzionali), e il tetrapeptide mostrato sopra (composto di quattro diversi aminoacidi) dovrebbe avere 24 isomeri costituzionali. Quando tutti e venti gli aminoacidi naturali sono possibili componenti di un peptide, le combinazioni possibili sono enormi. La semplice probabilità statistica indica che il decapeptide formato da tutte le possibili combinazioni di questi aminoacidi dovrebbe totalizzare 2010 isomeri costituzionali! I peptidi naturali di complessità variante sono abbondanti. Il semplice e variamente distribuito tripeptide glutatione (prima voce nell'elenco sotto), è interessante perché la funzione carbossilica in catena laterale dell'acido glutamico N-terminale viene usato per il legame peptidico. Un acido glutamico N-terminale può anche essere simile ad un lattame, come nel caso del TRH (seconda voce). L'abbreviazione per questa unità trasformata è pGlu (o pE), dove p sta per "piro" (tali chiusure d'anello avvengono spesso per riscaldamento). I peptidi più grandi nell'elenco spesso dimostrano l'importanza delle abbreviazioni di aminoacidi usate, dato che una formula strutturale completa per un nonapeptide (o più grande) si dimostrebbe complessa ed inefficiente. Le formule che usano abbreviazioni letterali sono colorate in rosso. I dieci peptidi elencati fanno uso di tutti e venti gli aminoacidi comuni. Notate che l'unità C-terminale ha la forma di una ammide in alcuni casi (TRH, angiotensina & ossitocina). Quando duo o più cisteine sono presenti nella catena peptidica, essono sono spesso unite tramite legami disolfuro (ossitocina & endotelina); e nel caso dell'insulina, due catene peptidiche separate (A & B) sono tenute assieme da tali connessioni. Alcuni peptidi naturali comuni • Glutatione (3 residui): si ritrova nella maggior parte delle cellule viventi, stimola la crescita dei tessuti; ha sequenza aminoacidica +H3NCH(CO2CH2CH2CONHCH(CH2SH)CONHCH2CO2H, γ-Glu-Cys-Gly (o γECG) • TRH (3 residui): neuroormone ipotalamico, governa il rilascio di tirotropina • Angiotensina II (8 residui): agente in grado di aumentare la pressione sanguigna, agisce sulla ghiandola surrenale; ha sequenza aminoacidica Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-PheNH2 (o DRVYIHPFNH2) • Bradichinina (9 residui): vasodilatatore ipotensivo, agisce sul muscolo liscio; ha sequenza aminoacidica: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg (o RPPGFSPFR) • Ossitocina (9 residui): ormone che contrae l'utero, stimola anche la produzione di latte • Somatostatina (14 residui): inibisce il rilascio dell'ormone della crescita, usata per il trattamento delle ulcere • Endotelina (21 residui): potente vasocostrittore, strutturalmente simile ad alcuni veleni di serpenti • Melittina (26 residui): veleno dell'ape domestica, usata per il trattamento dei reumatismi; ha sequenza aminoacidica: Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro~ ~Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-GlnNH2 (o GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQNH2) • Glucagone (29 residui): fattore iperglicemico, usato come anti-diabete; ha sequenza aminoacidica: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp~ ~Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (o HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT) • Insulina (51 residui): ormone pancreatico, usato nel trattamento dei diabeti I diversi aminoacidi che formano un peptide o una proteina, e l'ordine in cui sono uniti assieme tramite legami peptidici è definito struttura primaria. Dagli esempi mostrati sopra, dovrebbe essere evidente che non compito banale determinare la struttura primaria di tali composti, anche di quelli di modeste dimensioni. L'idrolisi completa di una proteina o di un peptide, seguita da analisi degli aminoacidi stabilisce la sua composizione grezza, ma non fornisce alcuna informazione circa la sequenza dei legami. L'idrolisi parziale produrrà una miscela di peptidi più corti e di alcuni aminoacidi. Se le strutture primarie di questi frammenti sono note, è qualche volta possibile dedurre parte o tutta la struttura originale traendo vantaggio dai pezzi che si sovrappongono. Per esempio, se un eptapeptide era composto da tre glicine, due alanine, una leucina ed una valina, potrebbero essere scritte molte strutture primarie possibili. D'altra parte, se l'idrolisi parziale aveva portato a due frammenti di un tripeptide noto e a due frammenti di un dipeptide noto, come mostrato sotto, la semplice analisi delle unità che si sovrappongono identifica la struttura primaria originale. Ovviamente, questo genere di determinazione della struttura è molto inefficiente ed inaffidabile. Primo, necessitiamo di sapere le strutture di tutti i frammenti che si sovrappongono. Secondo, i peptidi più grandi dovrebbero dare miscele complesse che dovrebbero essere separate ed esaminate meticolosamente per trovare pezzi adatti per la sovrapposizione. Dovrebbe essere notato, comunque, la moderna spettrometria di massa usa questa tecnica di sovrapossizione efficacemente. La differenza è che la scissione dei legami non è ottenuta tramite idrolisi, ed i computers velocizzano il processo comparando innumerevoli frammenti.

quimico

2011-12-16 10:58

3. Analisi del gruppo N-terminale Negli anni durante i quali i chimici avevano studiato questi prodotti naturali importanti, molte tecniche erano state usate per investigare la loro struttura primaria o la sequenza aminoacidica. Inoltre, gli strumenti commerciali che automaticamente sequenziano peptidi e proteine sono ora disponibili. Alcune delle più importanti tecniche comunemente usate saranno descritte qui. L'indentificazione delle unità N-terminale e C-terminale di aminoacidi di una catena peptidica fornisce un'informazione utile. L'analisi N-terminale è portata a termine tramite la degradazione di Edman, che è evidenziata nel seguente schema. Una funzione aminica libera, di solito in equilibrio con la specie zwitterionica, è necessaria per l'iniziale legame con il reagente fenile isotiocianato. I prodotti della degradazione di Edman sono un eterociclo tioidantoina che incorpora l'aminoacido N-terminale assieme ad un catena peptidica accorciata. Le funzioni aminiche su una catena laterale, come nella lisina, possono reagire con il reagente isotiocianato, ma non danno prodotti tioidantoinici. Il reagente fenile isotiocianato attacca e rimuove l'unità aminoacidica N-terminale nella forma di un eterociclo tioidantoina sostituito. I derivati caratteristici di questo tipo di tutti gli aminoacidi sono stati fatti e catalogati, così l'identificazione dell'unità terminale è portata a termine facilmente per paragone. Il gruppo amino terminale si addizione alla funzione reattiva isotiocianato a dare una tiourea sostituita. Questa metà è conformazionalmente mobile, e l'atomo di zolfo può avvicinarsi alla carbonile del carbossile di un aminoacido N-terminale. HCl anidro protona l'atomo di ossigeno dell'ammide, attivandolo verso l'attacco nucleofilo tramite zolfo. Poi, un eterociclo tiazolinone che incorpora l'unità N-terminale viene scisso, lasciando indietro una catena peptidica più corta. Questo anello eterociclico è instabile e subisce riarrangiamento acido catalizzato a tioidantoina isomerica (nel riquadro verde ombreggiato). Una vantaggio maggiore della procedura di Edman è che la catena peptidica rimanente non è ulteriormente degradata durante la reazione. Questo significa che l'analisi N-terminale può essere ripetuta diverse volte, fornendo quindi la sequenza dei primi tre-cinque aminoacidi nella catena. Uno svantaggio della procedura è che peptidi più grandi di 30-40 unità non danno risultati soddisfacenti. 4. Analisi del gruppo C-terminaleChimica L'analisi complementare C-terminale delle catene peptidiche può essere portata a termine chimicamente o enzimaticamente. L'analisi chimica è leggermente più complessa della procedura di Edman. Prima, i gruppi carbossilici in catena laterale e i gruppi idrossilici devono essere protetti come ammidi o esteri. Poi, il gruppo carbossile C-terminale viene attivato come anidride e fatto reagire con tiocianato. L'acile tiocianato risultante immediatamente ciclizza ad idantoina, e questa può essere scissa dalla catena peptidica in diversi modi, non descritti qui. A seconda della natura di questa scissione finale, la procedura può essere modificata per dare come prodotto un peptide acile tiocianato C-terminale che automaticamente riarrangia ad un tioidantoina che incorpora la penultima unità C-terminale. Quindi, analisi ripetute possono essere condotte in un modo molto simile a quello usato per la procedura di Edman. Enzimatica La scissione enzimatica dell'aminoacido C-terminale tramite uno dei diversi enzimi carbossipeptidasi è un metodo di analisi veloce e conveniente. Poiché il peptide prodotto accorciato è anche soggetto alla scissione enzimatica, deve essere fatta molta attenzione per controllare le condizioni di reazione così che i prodotti delle scissioni successive siano correttamente monitate. Il seguente esempio illustra questa caratteristica. Un peptide avente una sequenza C-terminale: ~Gly-Ser-Leu è soggetto alla scissione tramite carbossipeptidasi, e gli aminoacidi liberati in questa reazione sono analizzati ad intervalli di tempo crescenti. Sotto sono mostrati i risultati di questo esperimento. La leucina è scissa per prima, la serina per seconda, e la glicina per terza, come dimostrato dalla analisi sequenziale. ovviamente, la quarta e le quintà unità saranno anche esse rilasciate al passare del tempo, ma questi prodotti non sono mostrati.

quimico

2011-12-16 12:35

5. Scissione selettiva di peptidi

Dato che l'analisi dei gruppi terminali di grossi peptidi e proteina è di lavore limitato, i metodi di scissione selettiva come macromolecole in frammenti peptidici più piccoli sono comunemente impiegati come un passaggio importante nella comprensione strutturale.

Il bromuro di cianogeno (BrCN) è un metodo chimico, ha una specificità per il lato carbossilico dell'aminoacido metionina.

La tripsina è un metodo enzimatico, ha una specificità per il lato carbossilico di aminoacidi basici (ad esempio Lys & Arg).

La chimotripsina è un metod enzimatico, ha una specificità per il lato carbossilico di aminoacidi arilici (ad esempio Phe, Tyr & Trp).

Tutte queste procedure scindono le catene peptidiche in posizioni designate, e al lato carbossilico di un dato aminoacido.

Un meccanismo plausibile per la scissione con bromuro di cianogeno è evidenziato sotto. Il lato C-terminale della metionina è ottenuto come un peptide più piccolo, che può essere esaminato con una qualsiasi delle tecniche precedenti. Il lato N-terminale è caratterizzato da un lattone dell'omoserina alla sua estremità C-terminale.

I meccanismi per queste reazioni enzimatiche non sono facilmente formulati come per quelle chimiche. Altre scissioni enzimatiche sono state sviluppate, ma le due elencate qui serviranno per illustrare la loro applicazione.

Un esempio di analisi della struttura primaria

Per vedere come queste procedure possono essere combinate per comprendere la struttura primaria di un peptide, consideriamo l'ormone MSH (Melanocyte Stimulating Hormone) isolato dai maiali. Questo ottadecapeptide (18 unità aminoacidiche) ha la composizione: Arg, Asp2, Glu2, Gly2, His, Lys2, Met, Phe, Pro3, Ser, Tyr2, ed è abbreviato come P18. Il seguente schema, che inizia con i risultati dell'analidi dell'unità terminale, illustra i passaggi logici che potevano essere usati per risolvere il problema strutturale.

a) La scissione con il bromuro di cianogeno porta a due frammenti peptidici, il più lungo dei quali ha tutte le unità sul lato C-terminale della metionina.

b) L'analisi N-terminale del frammento undecapeptidico, P11, colloca i tre aminoacidi a destra della metionina.

c) La scissione tramite l'enzima tripsina del P11 mostra la posizione dell'arginina singola, che è ritrovata come unità C-terminale del frammento tetrapeptidico. Una delle due lisine è nota essere vicino all'estremità C-terminale. L'altro deve essere parte di un peptide più piccolo dalla reazione con il bromuro di cianogeno.

d) Con solo quattro aminoacidi rimanenti da posizionare, la posizione della seconda tirosina può essere ricercata tramite scissione con l'enzima chimotripsina del P18 stesso. Vengono ottenuti quattro frammenti, e la struttura finale potrebbe essere risolta da questi soltanto. Comunque, l'analisi selettiva del gruppo terminale dei due pentapeptidi serve a posizionare la tirosina e la seconda prolina vicino alla glicina più a sinistra, così come ad identificare le unità su ogni lato della metionina. L'unico aminoacido rimanente, una prolina, è quindi posizionata nell'ultimo sito vacante (riquadro giallo).

6. Peptidi ciclici

Se la funzione carbossilica all'estremità C-terminale di un peptide forma un legame peptidico con il gruppo amino N-terminale si forma un peptide ciclico. Le funzioni carbossilato ed amino sulle catene laterali possono anche essere combinarsi a formare anelli. I peptidi ciclici sono più comunemente ritrovati nei microorganismi, e spesso incorporano alcuni aminoacidi D così come aminoacidi insoliti come l'ornitina (Orn).

Il decapeptide, usato come antibiotico, gramacidina S, prodotto tramite da un ceppo del Bacillus brevis, è un esempio di questa interessante classe di prodotti naturali. La struttura della gramicidina S è mostrata nel seguente schema. Gli aminoacidi atipici sono colorati. Quando si usa un notazione stenografica per le strutture cicliche, la linea superiore è scritta tramite un convenzione solita (N-gruppo sulla sinistra), ma le linee verticali ed inferiori devono essere aggiustate per andare bene con il legame. Le frecce su questi legami puntano nella direzione CO-N di ogni legame peptidico.

quimico

2011-12-16 13:56

Relazioni tra struttura e proprietà

I composti che noi chiamiamo proteine esibiscono un vasto range di proprietà fisiche e biologiche. Sono comunemente riconosciute due categorie generali di proteine semplici.

Proteine Fibrose Come suggerisce il nome, queste sostanze hanno strutture di tipo fibroso, e servono come materiale strutturale principale in diversi tessuti. Corrispondente a questa funzione strutturale, esse sono relativamente insolubili in acqua ed inalterate da cambiamenti moderati della temperatura e del pH.

Sottogruppi all'interno di questo categoria includono:

• Collageni & Elastine, le proteine dei tessuti connettivi, di tenditi e dei legamenti.

• Cheratine, proteine che sono i componenti maggioritari di pelle, capelli, unghie e corna.

• Fibrina, una proteina formata quando il sangue coagula.

Proteine Globulari I membri di questa classe svolgono ruoli regolatori, di manutenzione e catalitico negli organismi viventi.

Esse includono ormoni, anticorpi ed enzimi, e si dissolvono o formano sospensioni colloidali in acqua.

Tali proteine sono generalmente più sensibili a cambiamenti della temperatura e del pH rispetto alle loro controparti fibrose.

1. La struttura secondaria e terziaria dei peptidi più grandi e delle proteine

Le diverse proprietà di peptidi e proteine dipendono non solo dai loro aminoacidi componenti e dalla loro sequenza dei legami nelle catene peptidiche, ma anche dal modo in cui le catene peptidiche sono allungate, arrotolate e piegate nello spazio. A causa delle loro dimensioni, le opzioni orientazionali aperte a queste macromolecole potrebbe sembrare quasi infinite. Fortunatamente, diversi fattori agiscono per restringere le opzioni strutturali, ed è possibile identificare alcuni temi strutturali comuni o strutture secondarie che appaiono ripetutamente in diverse molecole. Questi segmenti conformazionali sono a volte descritti tramite gli angoli diedri Φ & Ψ, definiti nello schema sotto.

La maggior parte delle proteine e dei peptidi più grandi non adottano conformazioni uniformi, e descrizioni complete delle loro disposizioni tridimensionali preferite sono definite come strutture terziarie.

Cinque fattori che influenzano gli equilibri conformazionali delle catene peptidiche sono:

• La planarità dei legami peptidici. Le conformazioni sono definite dagli angoli diedri Φ & Ψ.

• Il legame ad idrogeno dei gruppi carbonilici dell'amide verso i donatori N-H.

• L'affollamento sterico dei gruppi vicinali.

• La repulsione e l'attrazione di gruppi carichi.

• Il carattere idrofilico ed idrofobico dei gruppi sostituenti.

A. Avvolgimento elicoidale o α-elica

L'undecapeptide relativamente semplice mostrato nel diagramma seguente può adottare una conformazione lineare a zig-zag, come disegnato. Comunque, questa molecola preferisce assumere una conformazione a spirale elicoidale, come mostrato nel disegno sotto. Sette legami ad idrogeno, che assieme forniscono circa 30 kcal/mol di stabilità, aiutano a mantenere questa conformazione.

Esaminiamo la seconda struttura riportata sopra, il disegno centrale.

Il residuo N-terminale (Ala) è sulla sinistra, ed il residuo C-terminale Gly sulla destra. L'α-elica è destrorsa, che vuol dire che essa ruota in senso orario dato che essa si allontana dall'osservatore ad ogni estremità. Altre caratteristiche strutturali che definiscono un'α-elica sono: le posizione relative degli atomi donatori ed accettori del legame ad idrogeno, il numero di unità aminoacidiche per giro dell'elica e la distanza che il giro occupa lungo l'asse dell'elica. Il primo legame ad idrogeno (dall'estremità N-terminale) è dal gruppo carbonilico dell'alanina al gruppo N-H della fenilalanina. Tre aminoacidi, Thr, Gly & Ala, cadono interamente all'interna di questo giro. Anche parti dell'accettore N-terminale alanina e del donatore fenilalanina cadono all'interno di questo giro dell'elica, ed un'attenta analisi della struttura indica che ci sono 3.6 unità aminoacidiche per giro. La distanza coperta dal giro è di 5.4 Å. Usando la terminologia dell'angolo diedro, una perfetta α-elica ha Φ = -58° e Ψ = -47°. Nelle proteine naturali i valori associati alla conformazione α-elicoidale variano da -57 a -70° per Φ, e da -35 a -48° per Ψ.

Conformazioni elicoidali delle catene peptidiche possono anche esserre descritte tramite nm, dove n è il numero di unità aminoacidiche per giro dell'elica ed m è il numero di atomi nel più piccolo anello definito dal legame ad idrogeno. Usando questa terminologia, l'α-elica è un'elica 3.613. Altre comuni conformazioni elicoidali sono 310 e 4.416. L'α-elica è la più stabile di queste, costituendo per 1/3 le strutture secondarie trovate nella maggior parte delle proteine globulari (non fibrose).

B. Fogli β-piegati

La conformazioni lineare a zig-zag di una catena peptidica può essere stabilizzata tramite legame ad idrogeno verso catene parallele adiacenti dello stesso tipo. I sostituenti in catena laterale di grosse dimensioni destabilizzano questo arrangiamento a causa dell'affollamento sterico, così questa conformazione a fogli β è di solito limitata a peptidi avengi una grande quantità di glicina ed alanina. Le interazioni steriche causano anche un leggero piegamento o contrazione delle catene peptidiche, e questo provoca una distorsione pieghettata (il foglio piegato). Come mostrato nello schema seguente, le catene adiacenti possono essere orientate in direzioni opposte da N a C, definite antiparallele. Usando la terminologia dell'angolo diedro, un foglio β antiparallelo ha Φ = -139° e Ψ = 135°. Alternativamente, le catene peptidiche adiacenti possono essere orientante nella stessa direazione, definite parallele. Per convenzione, i fogli β sono designati da frecce larghe, in questo caso fucsia, che puntano nella direzione dell'estremità C-terminale.

Alcune proteine sono pile stratificate di fogli β, che impartiscono una integrità strutturale e possono aprirsi formando una cavità (un barile β). Un esempio è la proteina umana che lega il retinolo, che ha una cavità formata da otto fili di fogli β.

Quando i fogli β vengono osservati come componenti strutturali secondari di proteine globurali, essi sono ritorti di circa 5-25° per residuo; di conseguenza, i piani dei fogli non sono paralleli. L'ansa è sempre della stessa chiralità, e di solito è maggiore per i fogli antiparalleli.

C. Altre strutture

Sebbene la maggior parte delle proteine e dei grandi peptidi possano avere segmenti di α-elica e fogli β, le loro strutture terziarie possono essere costituite da turns, piegamenti e spirali meno altamente organizzati. I turns invertono la direzione della catena peptidica, e sono considerati essere un terzo motivo comune della struttura secondaria. Approssimativamente 1/3 di tutti i residui nelle proteine globulari sono ritrovati nei turns. I turns avvengono principalmente sulla superficie delle proteine, spesso incorporano residui polari e carichi, e sono stati classificati in tre sottogruppi.

Come notato prima, diversi fattori perturbano l'organizzazione delle catene peptidiche. Un fattore che non è stato ancora citato è l'influenza strutturale della prolina. Diversamente dagli altri aminoacidi comuni, la rotazione attorno al legame α C-N nella prolina non è possibile a causa della tensione strutturale dell'anello a cinque membri. Di conseguenza, la presenza di una prolina in una catena peptidica introduce un piegamento o nodo che stravolge le eliche o i fogli. Inoltre, le proline che sono parte di una catena peptidica non hanno donatori N-H di legami ad idrogeno per contribuire alla stabilizzazione del conformero.

Con l'eccezione della fibroina della seta e di alcuni peptidi sinteticamente costruiti, porzioni significative della maggior parte delle proteine adottano conformazioni che resistono alla descizione semplice o alla categorizzazione. Per esempio, il seguente disegno mostra la struttura terziaria di una neurotossina polipeptidica trovata nel veleno del cobra. Una grande sezione di fogli β antiparalleli è colorata in violetto, ed una corta α-elica è verde. La rimanente catena peptidica sembra disorganizzata, ma possono essere identificati alcune caratteristiche come un turn di 180° (β-turn) e cinque legami disolfuro.

quimico

2011-12-16 15:58

Esempi addizionali

Un descrizione ed un discussione completa della struttura delle proteine va ben oltre lo scopo di questo topic, ma alcuni esempi addizionali saranno istruttivi. In aggiunta alle strutture terziari che saranno mostrate, deve essere posta attenzione anche al modo in cui le strutture peptidiche possono aggregarsi per formare clusters dimerici, trimerici e tetramerici. Questi assemblamenti, noti come strutture quaternarie, hanno proprietà caratteristiche differenti dai loro componenti monomerici. Gli esempli riportati sotto dimostrano questa caratteristica.

Alcune proteine incorporano molecole non peptidiche nella loro struttura complessiva, legate in modo covalente o posizionate da altre forze. Queste vengono chiamate proteine coniugate, ed i componenti non peptidici sono chiamati gruppi prostetici. Esempi di proteine coniugate includono:

Glicoproteine, che incorporano come gruppi prostetici dei polisaccaridi (ad es. collagene ed il muco).

Lipoproteine, che incorporano come gruppi prostetici dei lipidi (ad es. HDL e LDL).

Cromoproteine, che incorporano come gruppi prostetici colorati (ad es. emoglobina).

L'endotelina & l'angiogenina sono piccoli peptidi che hanno proprietà fisiologiche importanti e selettive.

Il lisozima è una tipica proteina globulare, che incorpora molte strutture secondarie identificabili.

La mellitina, dal veleno dell'ape domestica, ha una struttura quaternaria ben definita, la metà della quale è mostrata qui.

Il collagene è una proteina fibrosa diffusamente distribuita con una struttura quaternaria grossa e complessa. Solo un piccolo segmento è mostrato qui.

La tioredossina è una proteina regolatoria relativamente piccola che svolge una importante funzione redox.

L'emoglobina, il più complesso di questi esempi, è una grossa proteina coniugata che trasporta ossigeno. Una persona del peso di 77 kg ha circa 1 kg di emoglobina distribuito tra più di cinque miliardi di globuli rossi. Un litro di sangue arterioso a temperatura corporea può trasportare più di 200 mL di ossigeno, mentre lo stesso fluido privato della sue emoglobina porterebbero solo 2-3 mL di ossigeno. L'assemblamento supramolecolare di quattro unità esemplifica una struttura quaternaria.

2. Struttura quaternaria delle proteine

Molte proteine sono in realtà assemblamenti di diversi polipeptidi, che nel contesto di un aggregato più grosso sono noti come subunità proteiche. Queste proteine con sottounità multiple possiedono una struttura quaternaria, in aggiunta alla struttura terziaria delle subunità. Le subunità della struttura quaternaria sono tenute assieme dalle stesse forze che sono responsabili per la stabilizzazione della struttura terziaria. Queste includono l'attrazione idrofobica delle catene laterali non polari nelle regioni a contatto delle subunità, le interazioni elettrostatiche tra gruppi ionici di carica opposta, legami ad idrogeno tra gruppi polari, e legami disolfuro. Esempi di proteine aventi una struttura quaternaria includono emoglobina, HIV-1 proteasi e l'esamero dell'insulina.

La molecole di emoglobina è un assemblaggio di quattro subunità proteiche, due unità α e due unità β. Ogni catena proteica si piega in un seti di segmenti strutturali ad α-elica connessi assieme in un arrangiamento globina, così chiamato perché questo arrangiamento è lo stesso motivo che si ripiega in altre proteine eme/globina come la mioglobina. Questo modo di piegarsi contiene una tasca che lega fortemente il gruppo eme. Le quattro catene polipeptidiche sono legate l'un l'altra tramite ponti salini, formando una struttura quaternaria tetramerica. Sotto è mostrato un modello dell'emoglobina.

Negli animali, l'emoglobina trasporta l'ossigeno dai polmoni o dalle branchie al resto del corpo, dove è rilasciato per l'uso cellulare. La capacità di legarsi all'ossigeno dell'emoglobina viene diminuita in presenza di monossido di carbonio perché entrambi i gas competono per gli stessi siti di legame sull'emoglobina. L'affinità di legame dell'emoglobina per il CO è 200 volte maggiore della sua affinità per l'ossigeno. Quando l'emoglobina si combina con il CO, essa forma un composto rosso davvero brillante chiamato carbossiemoglobina, che può causare un colorito roseo sulla pelle delle vittime morte per avvelenamento da CO. In fumatori incalliti, più del 20% dei siti attivi che legano ossigeno possono essere bloccati dal CO. In modo simile, l'emoglobina ha un'affinità di legame competitiva per l'anione cianuro, il monossido di zolfo, il diossido di azoto ed i solfuri incluso il solfuro di idrogeno. Tutti questi legano il ferro dell'eme senza cambiare il suo stato di ossidazione, causando grave tossicità e morte.

L'insulina è un ormone peptidico composto da 51 aminoacidi, con un peso molecolare di 5808 Da. L'insulina ha un forte effetto sul metabolismo e su altre funzioni del corpo, obbligando le cellule di fegato, muscoli, e tessuto grasso a raccogliere glucosio dal sangue, immagazzinandolo come glicogeno nel fegato e nel muscolo. L'insulina viene prodotta nel pancreas.

La struttura molecolare dell'insulina varia leggermente tra le specie animali. L'insulina suina è specialmente simile alla versione umana.

Le molecole di insulina hanno la tendenza a formare dimeri in soluzione a causa dei legami ad idrogeno tra le estremità C-terminali delle catene B. In presenza di ioni zinco, i dimeri dell'insulina si associano in esameri. L'insulina viene immagazzinata nel corpo come esamero, mentre la forma attiva è il monomero. Queste interazioni hanno importanti ramificazioni cliniche. Monomeri e dimeri rapidamente diffondono nel sangue; gli esameri diffono molto poco.

L'HIV-1 proteasi è un enzima prodotto dal virus dell'HIV che è essenziale per il suo ciclo vitale. Il virus produce certe proteine che necessitano di essere scisse o tagliate, al fine di trasformarle in proteine funzionali che permettano al virus di infettare nuove cellule. L'HIV-1 proteasi scinde le proteine nascenti nella loro forma funzionale. L'enzima è composto da due subunità simmetriche correlate, mostra sotto in modo tale da evidenziale la struttura secondaria.

Ogni subunità è costituita dalla stessa piccola catena di 99 aminoacidi, che si uniscono assieme in un modo tale da formare un tunnel dove si incontrano. La proteina per essere scissa giace in questo tunnel, che ospita il sito attivo dell'enzima. Due triadi catalitiche Asp-Thr-Gly, una su ogni catena, compongono il sito attivo. I due Asp agiscono come agenti catalitici principali, e assieme ad una molecola d'acqua scindono la catena proteica legata nel tunnel. Senza l'efficace HIV-1 proteasi, i virioni dell'HIV rimarrebbero non infettivi.

A causa del suo ruolo nella replicazione dell'HIV, l'HIV-1 proteasi è stata un bersaglio per i farmaci antivirali. Tali farmaci funzionano come inibitori, legandosi al sito attivo mimando l'intermedio tetraedrico del suo substrato, disabilitando quindi l'enzima. La struttura di uno di tali inibitori, BEA388, è mostrata qui sotto.

Tropomiosina

La seguente animazione mostra un segmento della proteina fibrosa tropomiosina, un comune regolatore muscolare. Le catene peptidiche sono in larga parte α-eliche. Queste sono avvolte in coppie di supereliche, che sono quindi allineate in una matrice parallela.

I seguenti utenti ringraziano quimico per questo messaggio: Max Fritz

quimico

2011-12-18 09:50

Sintesi di peptidi Al fine di sintetizzare un peptide dai suoi aminoacidi componenti, devono essere superati due ostacoli. Il primo di questi è statistico, ed è illustrato considerato il dipeptide Ala-Gly come obiettivo proposto. Se ignoriamo la chimica coinvolta, una miscela di quantità equimolari di alanina e glicina dovrebbe generare quattro differenti dipeptidi. Questi sono: Ala-Ala, Gly-Gly, Ala-Gly & Gly-Ala. Nel caso di tripeptidi, il numero di prodotti possibili da questi due aminoacidi sale ad otto. Chiaramente, un qualche tipo di selettività deve essere esercitato se vogliono essere evitate miscele complesse. La seconda difficoltà nasce dal fatto che gli acidi carbossilici e le amine primarie e secondarie non formano legami amidici quando miscelate, ma generalmente reagiranno tramite trasferimento di protone a dare sali (l'equivalente intramolecolare della formazione di uno zwitterione). Dalla prospettiva di un chimico organico, la sintesi peptidica richiede l'acilazione selettiva di un'amina libera. Per ottenere la formazione del legame ammidico desiderato, dobbiamo prima disattivamente tutte le funzioni aminiche estranee così che non competano con il reagente acilante. Quindi dobbiamo attivare selettivamente la funzione carbossilica designata così che essa acilerà l'unica amina libera rimanente. Fortunatamente, le reazioni chimiche che ci permettono di ottenere queste selezioni sono ben note. Primo, la basicità e la nucleofilicità delle amine è sostanzialmente ridotta tramite formazione dell'ammide. Di conseguenza, l'acilazione degli aminoacidi per trattamento con cloruri acilici o anidridi a pH > 10, come già descritto, serve a proteggere i loro amino gruppi dalla reazione successiva. Secondo, l'attivazione tipo alogenuro acilico o anidride di un reagente carbossilico specifico deve avvenire come preludio alla formazione del legame (ammide). Questo è possibile, a condizione che le reazioni che competono, e che coinvolgono altre funzioni carbossiliche che potrebbero essere presenti, siano precluse dalla formazione preliminaria dell'estere. Ricordate, gli estere sono agenti acilanti più deboli delle anidridi o degli alogenuri acilici. Infine, la dicicloesilcarbodiimmide (DCC) effettua la disidratazione della miscela di un acido carbossilico e di un'amina nella ammide corrispondente in condizioni relativamente blande. La struttura di questi reagente e del meccanismo delle sua azione verranno ora descritti. Facciamo prima una passo indietro. Il reagente acilante ideale dovrebbe essere un acido carbossilico, ma gli acidi stessi sono relativamente non reattivi con i nucleofili. Una soluzione semplice per questa inattività fu di convertire l'acido carbossilico in un derivato più reattivo come un cloruro acilico o un'anidride. Una procedura alternativa meno estrema, spessa usata in casi difficili, fa uso di reagenti che selettivamente attivano un gruppo carbossilico tramite sostituzione nucleofila. Due reagenti tali sono la dicicloesilcarbodiimmide (DCC) ed il carbonildiimidazolo (reagente di Staab). Le equazioni seguenti forniscono esempi del loro uso nella preparazione di esteri, ammidi, anidridi e peresteri. Inoltre, la riduzione con LAH dell'intermedio imidazoluro generato dal reagente di Staab fornisce una preparazione utile di aldeidi dagli acidi. I meccanismi tramite cui questi reagenti attivano gli acidi carbossilici sono mostrati sotto. Tenete in mente che l'imidazolo è un acido più forte dell'acqua ed un gruppo uscente migliore dell'anione idrossido, specialmente se protonato. La sua applicazione alla sintesi peptidica diventerà chiara nella discussione che segue. La strategia per la sintesi peptidica, come sottolineato qui, dovrebbe ora essere chiara. Il seguente esempio mostra una sintesi selettiva del dipeptide Ala-Gly. Un compito importante rimane da affrontare. Dato che il gruppo N-protettivo è una ammide, la rimozione di questa funzione potrebbe richiedere condizioni che potrebbero scindere anche l'appena formato legame peptidico. Inoltre, le condizioni violente spesso richieste per l'idrolisi dell'ammide potrebbero causare considerevole racemizzazione degli aminoacidi nel peptide risultante. Questo problema colpisce al cuore della nostra strategia, così è importante fare attenzione durante la progettazione di gruppi N-protettivi specifici. In particolare, tre qualità sono volute: 1) L'ammide protetta dovrebbe essere facile da attaccare dagli aminoacidi. 2) Il gruppo amino protetto non dovrebbe reagire nelle condizioni di formazione del peptide. 3) Il gruppo ammidico protetto dovrebbe essere facile da rimuovere in condizioni blande. Un numero di gruppi protettivi che soddisfano queste condizioni è stato ideato; e due dei più diffusamente usati gruppi protettivi, carbobenzossi (Cbz) e t-butossicarbonil (BOC o t-BOC), sono descritti qui. I reagenti per l'introduzione di questi gruppi N-protettivi sono i cloruri acilici o le anidridi mostrate nella porzione sinistra dello schema sopra. La reazione con una funzione aminica libera di un aminoacidi avviente rapidamente a dare il derivato aminoacidico "protetto" mostrato al centro. Questo può quindi essere usato per formare il legame peptidico (ammidico) con un secondo aminoacido. Una volta creato il legame peptidico desiderato, il gruppo protettivo può essere rimosso in condizioni relativamente blande, non idrolitiche. Le equazioni che mostrano la rimozione del gruppo protettivo sono mostrate sopra. La scissione dei gruppi reattivi benzile o t-butile generat un comune intermedio acido carbammico (HOCO-NHR) che perde spontaneamente CO2, dando l'amina corrispondente. Se il metil estere all'estremità C-terminale è lasciato in loco, questa sequenza di reazioni può essere ripetuta, usando un differente aminoacido N-protetto come agente acilante. La rimozione dei gruppi protettivi dovrebbe quindi portare ad un tripeptide specifico, determinato dalla natura dei reagenti e dall'ordine delle reazioni.

quimico

2011-12-18 10:43

La sintesi di un peptide di lunghezza significativa (cioè 10 residui) tramite questo approccio richiede molti passaggi, e il prodotto deve essere attentamente purificato dopo ogni passaggio per evitare reazioni incrociate indesiderate. Per facilitare purificazioni noiose e che fanno perdere tempo, e ridurre perdite materiali che avvengono nel maneggiare tali prodotti, è stata sviluppata una modificazione astuta di questa strategia. Questa procedura, nota come sintesi di Merrifield, dall'inventore R. Bruce Merrifield, comporta l'attacco dell'estremità C-terminale di una catena peptidica ad un polimero solido, di solito avente la forma di palline davvero piccole. La separazione e la purificazione è ottenuta semplicemente filtrando e lavando le perline con solventi appropriati. I reagenti per la successiva addizione al legame peptidico sono quindi aggiunti, ed i passaggi di purificazione ripetuti. L'intero processo può essere automatizzato, e sono disponibili commercialmente macchine per la sintesi peptidica basate sull'approccio di Merrifield.

Una serie di equazioni che illustrano la sintesi di Merrifield possono essere viste sotto. Il passaggio finale, in cui il peptide completato è rilasciato dal polimero di supporto, è una semplice scissione di un benzil estere. Questo non è mostrato qui.

Due o più peptidi moderatamente dimensionati possono essere uniti assieme tramite formazione selettiva di un legame peptidico, e le funzioni in catena laterale a disposizione sono protette e non interferiscono. In questo modo i peptidi ben dimensionati e le piccole proteine possono essere sintetizzate in laboratorio. Comunque, anche se i chimici assemblano la struttura primaria di una proteina naturali in questo o in altro modo, essa non può immediatamente adottare la sua struttura secondaria, terziaria e quaternaria nativa. Molti fattori, come pH, temperatura e concentrazione di ioni inorganici influenzano l'avvolgimento conformazionale delle catene peptidiche. Inoltre, gli scienziati stanno ancora cercando di capire come e perché queste strutture superiore sono stabili negli organismi viventi.

quimico

2011-12-19 16:00

Denaturazione Le strutture naturali o native delle proteine possono essere alterate, e la loro attività biologica cambiata o distrutta tramite trattamenti che non distruggono la struttura primaria. Questa denaturazione è spesso fatta deliberatamente durante la separazione e la purificazione delle proteine. Per esempio, molte proteine globulari solubili precipitano se il pH della soluzione è fissato al pI della proteina. Inoltre, l'aggiunta di acido tricloroacetico o della bis-ammide urea (NH2CONH2) è comunemente usata per condurre la precipitazione della proteina. In seguito alla denaturazione, alcune proteine ritorneranno alle loro strutture native in condizioni opportune; ma le condizioni estreme, come il forte riscaldamento, di solito causano un cambiamento irreversibile. Alcuni trattamenti noti per denaturare le proteine sono elencati sotto. Azione denaturante - Meccanismo Calore I legami ad idrogeno vengono rotti dall'aumentata energia traslazionale e vibrazionale. (Coagulazione del bianco d'uovo, albumina, per frittura) Radiazione UV Simile al calore (Scottatura solare) Acidi o basi forti Formazione di un sale; rottura dei legami ad idrogeno. (Vesciche ed ustioni cutanee, precipitazione delle proteine) Soluzione di urea Competizione per i legami ad idrogeno. (Precipitazione delle proteine solubili) Alcuni solventi organici (etanolo & acetone) Cambiamento nella costante dielettrica ed idratazione dei gruppi ionici. (Azione disinfettante e precipitazione delle proteine) Agitazione Rottura dei legami ad idrogeno. (Sbattendo il bianco dell'uovo, albumina, ottendendo una meringa) Non tutte le proteine sono facilmente denaturate. Come notato sopra, le proteine fibrose come le cheratine, i collageni e le elastine sono proteine robuste, relativamente insolubili, a struttura quaternaria che giocano un ruoli importanti nella struttura fisica degli organismi. Le strutture secondarie come l'α-elica e il foglio β assumono un ruolo dominante nell'architettura e nell'aggregazione delle cheratine. Oltre ai legami ad idrogeno intra- ed intermolecolari di queste strutture, le cheratine hanno grosse quantità di aminoacidi contenenti zolfo Cys, con formazione di ponti disolfuro che conferiscono forza e rigidità addizionale. Le più flessibili ed elastiche cheratine dei capelli hanno meno ponti disolfuro intercatena rispetto alle cheratine di unghie, zoccoli e artigli dei mammiferi. Le cheratine hanno un'elevata proporzione dell'aminoacido più piccolo, Gly, così come del più piccolo successivo, Ala. Nel caso dei fogli β, la Gly permette legami ad idrogeno stericamente liberi tra i gruppi amino e carbossile dei legami peptidici su catene di proteine adiacenti, facilitando il loro allineamento prossimo ed il forte legame. Le catene fibrose di cheratina quindi si avvolgono l'una attorno all'altra per formare filamenti elicoidali. Anche l'elastina, la proteina del tessuto connettivo, ha un'elevata percentuale sia di glicina che di alanina. Una proteina insolubile tipo gomma, l'elastina conferisce elasticità ai tessuti e agli organi. L'elastina è un polimero macromolecolare formato da tropoelastina, il suo precursore solubile. La struttura secondaria è circa per il 30% fogli β, per il 20% α-eliche e per il 50% disordinata. Le proprietà elastiche dell'elastina naturale sono attribuite alle sequenze polipentapeptidiche (Val-Pro-Gly-Val-Gly) in una rete cross-linked di catene causalmente avvolte. Si crede l'acqua agisca da "plastificante", assistendo l'elasticità. Il collagene è il componente maggioritario della matrice extracellulare che supporta la maggior parte dei tessuti e dona alle cellule la struttura. Esso ha una grande resistenza alla trazione, ed è il componente principale delle fasce muscolari, della cartilagine, dei legamenti, dei tendini, delle ossa e della pelle. Il collagene contiene più derivati di Gly (33%) e di Pro (20-24%) rispetto alle altre proteine, ma molto poca Cys. La struttura primaria del collagene ha un motivo ripetitivo frequente, Gly-Pro-X (dove X è un idrossile che reca Pro o Lys). Questo genere di ripetizione regolare e l'elevato contenuto di glicina è ritrovato in solo poche altre proteine fibrose, come la fibroina della seta (75-80% Gly ed Ala + 10% Ser). Le catene di collagene sono approssimativamente lunghe 1000 unità, ed assumono un conformazione estesa sinistrorsa ad elica a causa dell'influenza degli anelli prolinici. Tali tre catene sono avvolte l'un l'altra con un giro destrorso a formare una struttura quaternaria superelicoidale tipo corda, stabilizzata da legami ad idrogeno intercatena. Le proteine globulari sono più solubili in soluzione acquose, e sono generalmente più sensibili al cambiamento della temperatura e del pH rispetto alle loro controparti fibrose; quindi, esse non ha l'elevato contenuto di glicina delle sequenze ripetitive delle proteine fibrose. Le proteine globulari incorporano una varietà di aminoacidi, molti con grosse catene laterali e gruppi funzionali reattivi. Le interazioni di questi sostituenti, sia polari che non polari, spesso causano il ripiegamento della proteina in conformazioni sferiche che danno il nome a questa classe. Diversamente alla funzione strutturale giocata dalle proteine fibrose, le proteine globurali sono chimicamente reattive, dato che servono come enzimi (catalisi), agenti di trasporto e messaggeri regolatori. Sebbene le proteine globulari siano generalmente sensibili alla denaturazione (apertura strutturale), alcune possono essere notevolmente stabili. Un esempio è il piccolo enzima ribonucleasi A, che serve a digerire l'RNA nel nostro cibo scindendo il legame tra ribosio e fosfato. La ribonucleasi A è notevolmente stabile. Una procedura per purificarla comporta il trattamento con una soluzione calda di acido solforico, che denatura e parzialmente decompone la maggior parte delle proteine rispetto alla ribonucleasi A. Questa stabilità riflette il fatto che questo enzima funziona nell'ambiente inospitale del tratto digerente. La ribonucleasi A fu il primo enzima sintetizzato da R. Bruce Merrifield, dimonstrando che le molecole biologiche sono semplicemente entità chimiche che possono essere costruite artificialmente.

Beefcotto87

2012-09-09 13:07

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