Analisi quantitativa Total Phenolic Content
Buongiorno a tutti, 
Mi chiamo Marco, é il mio primo post sul forum, quindi datemi un secondo per presentarmi. Laureato di biotecnologie industriali e con un master in Etnobiofarmacia, vivo in Peru da ottobre per uno stage. Qui le strumentazioni sono piuttosto scarse, ma fortunatamente abbiamo uno spettrofotometro (non sappiamo se é calibrato o no!). é per questo che per curiositá ho provato lo stesso esperimento su un altro spettrofotometro, ma con gli stessi risultati. Ho di fronte a me un problema di chimica analitica molto semplice, ma giuro che dopo mesi di ricerche non sono riuscito a trovare una soluzione, né io, né gente piú preparata di me. Vorrei capire dove sta l' errore, se c'é un errore! 

Allora sto facendo un'analisi quantitativa sul contenuto di fenoli in una matrice di origine vegetale (un'estratto secco) sfruttando spettrofotometro, lettura a 765 nm, reattivo di Folin e standard di acido gallico. Un classico diciamo. Il metodo, scoppiazzato dalla letteratura, l'abbiamo provato piu' volte e sembra funzionare: risposta lineare tra concentrazioni crescenti di acido gallico e valori di assorbanza  (R2 di 0,995). 

Allora noi procediamo cosí:

  1. Curva di calibrazione dell'acido gallico a concentrazioni 0,4 0,3 0,2 0,1 0,05 0,025 mg/mL ottenute partendo da una madre (solitamente 10 mg/10 mL = 1mg/mL)
  2. Troviamo la retta mediante microsoft excel e la funzione di tale retta del tipo y= mx + q (ovviamente se sostituisco alla y i valori di assorbanza trovati troviamo i valori di concentrazione e tali valori moltiplicati per il loro fattore di diluizione D danno la concentrazione di 1m/1mL)
  3. Ora: prepariamo il nostro estratto vegetale... mettiamo una concentrazione di 100 mg di estratto in un mL di metanolo. E di questo facciamo una serie di diluizioni 1/2 (50 mg/1 mL; 25 mg/1mL; 12.5 mg/1 mL ecc.). Nel nostro caso abbiamo usato basse concentrazioni di estratto dal momento che ad alte concentrazioni c'era un interferenza (a 765 nm con un po' di estratto sciolto in metanolo leggeva). Abbiamo considerato quindi le diluizioni D= 16, 32, 64 e 128.
     
  4. Reazione con folin e lettura delle assorbanze. Allora. Dal momento che abbiamo preso diverse concentrazioni di estratto vegetale (per vedere se c'era un plateau che avrebbe falsato l'analisi), otteniamo diversi valori di Gallic acid equivalent (GAE) che IN TEORIA, se moltiplicati con il loro differente fattore di diluizione, dovrebbero alla fine portare allo stesso Total Phenolic Content (TPC), cosi´come accadeva con gli standard. Cioe´se io considero la soluzione con fattore di diluizione 16 , per trovare il contenuto in fenoli  della mia soluzione di partenza (TPC), dovró moltiplicare per 16 ed IN TEORIA il tale valore di TPC dovrebbe corrispondere al valore della soluzione con fattore di diluizione 128 moltiplicato per 128. In altre parole: il TPC e' sempre quello. Se io parto da diverse concentrazioni di campione, dovrei in teoria sempre tornare allo stesso valore di TPC ovviamente considerando le diverse diluizioni. 
  5. La pratica, maledetta pratica, dice tutt'altro: ho fatto in totale sui 10-11 esperimenti diversi con sostanze diverse e... niente: a piu´basse concentrazioni di estratti (piu alti valori di diluizioni), si ottengono valori piú alti di TPC: cioé ad esempio se partendo da un soluzione a concentrazione 1 trovo un TPC di 5 mg di fenoli in 1 mL di soluzione iniziale, partendo da una concentrazione 0,001 dello stesso estratto, trovo un valore di TPC che é ad esempio 8 mg di fenoli in un mL di soluzione iniziale (che in termini di mg di fenoli in 1 g di estratto vegetale si parla di 50 mg/1 g e 80 mg/1g : una bella differenza!)
La domanda e' : quanto e' il mio TPC ??? Come si fa a calcolarlo???? Io pensavo: basta prendere una qualsiasi concentrazione e moltiplicare il suo GAE per la sua diluizione per ottenere il valore di TPC, ed invece a valori diversi di concentrazione, trova GAE diversi (e fino a qua ci siamo) ma anche TPC diversi (perché???). Spero abbiate capito, sono disperato :'( 

Grazie per la lettura, e ringrazio anticipatamente chi si offre di rispondermi!

Allego l'excel con :

curva calibrazione acido gallico

TPC di diverse concentrazioni di estratto vegetale!


Allegati
.xlsx  tpc marco.xlsx (Dimensione: 15.55 KB / Download: 52)
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Le domande nell'apposita sezione, così come le presentazioni!
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(2017-01-19, 17:36)Beefcotto87 Ha scritto: Le domande nell'apposita sezione, così come le presentazioni!

Ok scusami, grazie :-)

Ho pensato: mettiamolo in chimica analitica! Invece era su dubbi! Okkk
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Che volume finale hanno le soluzioni finali standard di acido gallico con le quali è stata costruita la curva di calibrazione?

Che volume finale hanno le soluzioni di estratto delle quali hai misurato l'Abs?

Penso che l'inghippo nei calcoli risieda in questi due volumi che non capisco quali siano da ciò che hai scritto... magari non li vedo io ;-)
Ciao
Luisa

Dal laboratorio se ne usciva ogni sera, e più acutamente a fine corso, con la sensazione di avere “imparato a fare una cosa”;
il che, la vita lo insegna, è diverso dall’avere “imparato una cosa”.
(Primo Levi)


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[-] I seguenti utenti ringraziano LuiCap per questo post:
marco88
(2017-01-19, 20:30)LuiCap Ha scritto: Che volume finale hanno le soluzioni finali standard di acido gallico con le quali è stata costruita la curva di calibrazione?

Che volume finale hanno le soluzioni di estratto delle quali hai misurato l'Abs?

Penso che l'inghippo nei calcoli risieda in questi due volumi che non capisco quali siano da ciò che hai scritto... magari non li vedo io ;-)

Allora, a livello pratico io ho preparato una soluzione di 10 mg di acido gallico in 10 mL di etanolo. Di questa soluzione 1mg/mL ho prelevato 0,4 mL e portati a 1 mL con etanolo per ottenere la concentrazione di 0,4 mg/mL. Da questa soluzione ho prelevato 0,25 mL per farli reagire con 0,25 mL di folin, 0,5 di carbonato di calcio e 4 mL di acqua. Soluzione finale = 5 mL. Di questi 5 mL ne ho versati un po in cuvetta. Anche se con tutti questi passaggi la diluizione aumenta, ho considerato solo la concentrazione di 0,4 mg/mL presente in 0,25 mL a cui ho letto il rispettivo valore di assorbanza e con la quale ho costruito la rispettiva curva di calibrazione.

Per quanto riguarda l'estratto, ho semplicemente fatto una serie di diluizioni e da queste ho prelevato 0,25 mL. 

Pertanto direi che i volumi analizzati a diverse concentrazioni sono sempre stati di 0,25 mL!
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Dalla descrizione di ciò che hai fatto, la concentrazione di acido gallico portata allo spettrofotometro non è 0,4 mg/mL, ma 0,02 mg/mL: hai confuso la concentrazione con la quantità ;-)

   

Quindi la curva di calibrazione non ha i valori di concentrazione di acido gallico che hai scritto.

Scrivimi anche tutti i passaggi di come hai diluito l'estratto.
Ciao
Luisa

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(2017-01-20, 00:20)LuiCap Ha scritto: Dalla descrizione di ciò che hai fatto, la concentrazione di acido gallico portata allo spettrofotometro non è 0,4 mg/mL, ma 0,02 mg/mL: hai confuso la concentrazione con la quantità ;-)



Scrivimi anche tutti i passaggi di come hai diluito l'estratto.

Eheh e qui comincia un problema con cui ci siamo sbattuti per settimane! Io ho fatto due curve di calibrazione: in una ho fatto una curva di calibrazione dove, come ha detto giustamente lei, ho inserito la concentrazione dell'acido gallico presente nei 5 mL che ho preparato che finiscono in cuvetta. E con queste concentrazioni ho trovato la seguente retta: y= 102,82x + 0,0502. 

Tuttavia la retta di cui parlavo io l'ho costruita a partire dai valori di concentrazione di acido gallico presenti nei 0,25 mL di standard che aggiungo. Questa retta si ricava dall'equazione y= 5,1409x + 0,0502. 

Lei dirá che quella esatta é la prima, ma in realtá i risultati del TPC sono UGUALI a quelli ottenuti utilizzando la seconda curva (ovviamente si abbassa di molto il GAE, precisamente di un fattore 20, dal momento che in 5 mL gli equivalenti in acido gallico sono diluiti 20 volte rispetto a 0,25 mL). Di conseguenza per tornare al nostro TPC del campione, dobbiamo moltiplicare il GAE per nuovi fattori di diluizione: il TPC non cambia. 

Esempio numerico:

Curva 1 --> y= 102,82x + 0,0502                      Curva 2 --> 5,1409x + 0,0502

Concentrazioni in 5 mL(mg/mL)                    Concentrazioni in 0,25 mL(mg/mL)      
0.3125                                                             6.2500
0.15625                                                           3.1250 
0.078125                                                         1.5625
0.0390625                                                       0.7813                                                      
                                                                     
                                                                   
Fattori di diluizione corrispondenti (dalla madre 100 mg/1 mL)
320                                                                   16                                                             
640                                                                   32
1280                                                                 64
2560                                                                 128


GAE in 5 mL (approssimati)                              GAE in 0,25 mL
0.011                                                                 0.214  
0.006                                                                 0.126
0.004                                                                 0.076
0.004                                                                 0.046


TPC:
3.43 (0.011*320 = 0.214*16)
4.02
4.89
5.95

Rispondendo alla seconda domanda di diluizione dell'estratto, ho fatto tutto in maniera molto semplice:

diluizioni seriali 1/2. Ovvero preso un vial e messo dentro 2 mL di estratto 100 mg/1mL. Da questo vial, ho preso 1 mL e l'ho trasferito in un vial con 1 mL di metanolo e mescolato bene. Poi da quel vial ho preso un altro mL e l'ho trasferito in un altro vial con 1 mL di metanolo e via cosí. Pertanto avró una serie di vials con concentrazioni che saranno una metá dell'altra! Ripeto peró che la concentrazione non diluita (100% del mio estratto) ovvero la 100 mg/1mL non l'ho analizzata perché mi dava problemi di lettura (senza reazione leggeva 0.800 circa di assorbanza!). 

Pertanto ripeto la mia domanda iniziale: perché a diluizioni diverse risalgo a TPC diversi?Quale dovrei considerare allora?
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Non ci capiamo :-(
La concentrazione, in qualsiasi unità di misura la si esprima, è una grandezza intensiva, cioè 1 mL e 1000 mL della stessa soluzione la stessa concentrazione.

Come hai calcolato queste concentrazioni?
Concentrazioni in 5 mL(mg/mL) Concentrazioni in 0,25 mL(mg/mL)
0.3125 6.2500
0.15625 3.1250
0.078125 1.5625
0.0390625 0.7813
Prendo come esempio 0.3125.
Io capisco che questa soluzione ha una concentrazione di GAE di 0,3125 mg/mL. Che siano 5, 10, 100 mL di soluzione la concentrazione non cambia.
Se sei partito da una soluzione madre avente una concentrazione di 100 mg/mL il fattore di diluizione giustamente è 320.
Il punto è il procedimento che mi hai scritto ieri non porta ad alcuna delle concentrazioni che hai scritto.
E allora non capisco più :-(

Come hai calcolato queste quantità?
GAE in 5 mL (approssimati) GAE in 0,25 mL
0.011 0.214
0.006 0.126
0.004 0.076
0.004 0.046

Questi dati, a mio parere sono sbagliati; secondo me sono:
Quantità (mg) GAE in 5 mL Quantità GAE (mg) in 0,25 mL
0.3125 mg/mL x 5 mL = 1.56 mg 6.2500 mg/mL x 0,25 mL = 1.56 mg
0.15625 x 5 = 0.781 3.1250 x 0,25 = 0.781
0.078125 x 5 = 0.391 1.5625 x 0,25 = 0.391
0.0390625 x 5 = 0.195 0.7813 x 0,25 = 0.195

Passiamo all'estratto.
Ho capito le diluizioni seriali che hai fatto, ma ad un certo punto avrai prelevato un volume x, aggiunto i reattivi, portato a 5 mL e letto allo spettrofotometro. Quanto vale x? Tu devi sapere quanto estratto c'è nel volume finale della soluzione finale che hai messo in cuvetta.
Ciao
Luisa

Dal laboratorio se ne usciva ogni sera, e più acutamente a fine corso, con la sensazione di avere “imparato a fare una cosa”;
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(Primo Levi)


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(2017-01-20, 23:43)LuiCap Ha scritto: Non ci capiamo :-(
La concentrazione, in qualsiasi unità di misura la si esprima, è una grandezza intensiva, cioè 1 mL e 1000 mL della stessa soluzione la stessa concentrazione.

E fino a qua ci siamo, tant'é che in cuvetta non ho messo 5 mL ma una quantitá X della soluzione portata a 5 mL. Quantitá X perché l'ho semplicemente versata non importandomi della quantitá. 

Come hai calcolato queste concentrazioni?

Allora ripeto le ho calcolate cosí: Ho preparato la "madre" cioé estratto secco e metanolo. Ho pesato 1 grammo di estratto secco e mescolato con 10 mL di metanolo. 1 grammo/10 mL = 100 mg/1mL vero? Con la mia madre concentrata 100 mg/1 mL ho preparato una serie di diluizioni ognuna con volume finale di 1 mL: 
100% della madre (significa che prendo semplicemente la mia madre, cioé 100 mg di estratto secco/1mL metanolo)
50% della madre (significa che diluisco una volta la mia madre: 50 mg estratto secco/1 mL metanolo)
25% della madre (25 mg estratto secco/1mL metanolo)
12.5% (12,5 mg estratto secco/1 mL metanolo)
6.25% (6,25 mg estratto secco/1 mL metanolo)
3.13% (3,13 mg estratto secco/1 mL metanolo)
1.56% (1,56 mg estratto secco/1 mL metanolo)
0.78% (0.78 mg estratto secco/1 mL metanolo)

Queste serie diluizioni espresse come mg di estratto secco della pianta in 1 mL di metanolo. Di questo mL di soluzione, ho preso 0,25 mL facendoli reagire con 0,25 di folin, 0,5 di Na2Co3 e 4 mL di acqua. Pertanto in 5 mL non avró piu questi valori, ma diluiti di un fattore 20 (5/0.25=20), pertanto avró i seguenti valori:
0.3125 mg di estratto secco/mL di soluzione finale
0.15625 mg di estratto secco/mL di soluzione finale 
0.078125 mg di estratto secco/mL di soluzione finale 
0.0390625 mg di estratto secco/mL di soluzione finale 

Questo non é il GAE, ma é la quantitá di estratto secco presente in un mL di soluzione. Il GAE si calcola a partire dai dati di assorbanza forniti dallo spettrofotometro. Se io sostituisco questi valori di assorbanza alla Y della equazione della retta di calibratura che deriva dalla lettura degli standard  di GA, cioé  y = 102.82x + 0.0502 , mi trova i diversi valori di GAE.
 
 
Concentrazioni in 5 mL(mg/mL) Concentrazioni in 0,25 mL(mg/mL)
0.3125 6.2500
0.15625 3.1250
0.078125 1.5625
0.0390625 0.7813
Prendo come esempio 0.3125.
Io capisco che questa soluzione ha una concentrazione di GAE di 0,3125 mg/mL. Che siano 5, 10, 100 mL di soluzione la concentrazione non cambia.
Se sei partito da una soluzione madre avente una concentrazione di 100 mg/mL il fattore di diluizione giustamente è 320.
Il punto è il procedimento che mi hai scritto ieri non porta ad alcuna delle concentrazioni che hai scritto.
E allora non capisco più :-(

Come hai calcolato queste quantità?
GAE in 5 mL (approssimati) 
0.011 0.214
0.006 0.126
0.004 0.076
0.004 0.046

Con il metodo descritto sopra, cioé: il contenuto di fenoli presenti in un campione si stima a partire dei dati di assorbanza: a 765 nm lo strumento nota un assorbimento del composto che si forma dalla reazione dei fenoli con il reattivo di folin. Se io inserisco quantitá note di acido gallico posso costruire una retta di calibrazione dalla cui equazione posso ricavare i dati di X se conosco l'assorbanza. L'assorbanza dipende dalla concentrazione. Caso 1:

Retta: y = 102.82x + 0.0502
concentrazione = 0.3125 mg in 1 mL di soluzione
Assorbanza letta = 1.15
Ora 1.15(y) = 102.82x + 0.0502 --> x = (1.15-0.0502)/102.82 = 0.010696.... 

Caso 2: 

Retta: y = 102.82x + 0.0502
concentrazione = 0.0390625 mg in 1 mL di soluzione

Assorbanza letta = 0.290
Ora 0.290(y)= 102.82x + 0.0502 --> x = (0.290-0.0502)/102.82 = 0.00233....

Questi due valori sono quindi il GAE espressi come mg di equivalenti di acido gallico presenti in 1 mL di soluzione di 5 mL preparata. Ovviamente per tornare al dato vero, devo moltiplicare per il fattore di diluizione che nel primo caso é 100/0.3125 = 320, nel secondo 100/0.0390625 = 2560 e via cosí. Dal momento che questo calcolo serve per risalire al dato iniziale, ovvero: quanti mg di fenoli ho in una soluzione 100 mg/1mL di estratto secco di pianta, in teoria qualsiasi valore dovrebbe risalire allo stesso valore di concentrazione di fenoli. Ed invece NO. 

Caso 1 = 0.010696*320 = 3.42272 = TPC (total phenolic content)
Caso 2 = 0.00233*2560 = 5.9648 = TPC (total phenolic content)

Vorrei capire da dove viene questa differenza ?! Questi risultati non sono casuali ma si ripetono per ogni campione che analizzo: piú diluito é l'estratto, piú alto é il valore di TPC che risulta 




Questi dati, a mio parere sono sbagliati; secondo me sono:
Quantità (mg) GAE in 5 mL Quantità GAE (mg) in 0,25 mL
0.3125 mg/mL x 5 mL = 1.56 mg 6.2500 mg/mL x 0,25 mL = 1.56 mg
0.15625 x 5 = 0.781 3.1250 x 0,25 = 0.781
0.078125 x 5 = 0.391 1.5625 x 0,25 = 0.391
0.0390625 x 5 = 0.195 0.7813 x 0,25 = 0.195

Passiamo all'estratto.
Ho capito le diluizioni seriali che hai fatto, ma ad un certo punto avrai prelevato un volume x, aggiunto i reattivi, portato a 5 mL e letto allo spettrofotometro. Quanto vale x? Tu devi sapere quanto estratto c'è nel volume finale della soluzione finale che hai messo in cuvetta.

0,25 mL. 






Ho riportato in nero le mie risposte alle sue domande. Spero si capisca ora. Chiedo scusa per il ritardo, ho diverso lavoro da fare qui in amazzonia :-)
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Appurato che abbiamo due modi diversi di fare i calcoli (e questo si era già capito ;-) ), ho provato ad eseguirli anche con il mio metodo.
Sperando di non aver commesso errori, sono questi:

   

Ti allego anche il foglio di calcolo che ho provato a rifare:


.xls  TPC Luisa.xls (Dimensione: 45.5 KB / Download: 22)

Nel foglio 'protocollo marco' trovi le due possibili curve di calibrazione e sotto i calcoli sull'estratto.
Non c'è verso, la concentrazione di TPC in mg/g estratto del campione risulta diversa.
Penso, ma ovviamente non ne sono sicura, che i tanti passaggi eseguiti per diluire l'estratto abbiano un peso molto grande sulla precisione dei risultati che si ottengono; infatti questi ultimi hanno una deviazione standard troppo elevata e non accettabile per un metodo analitico.
Dato però che mi ci sono "intrippata" pure io, nel secondo foglio di calcolo 'proposta luisa' ti propongo un metodo diverso per diluire l'estratto: dalla soluzione madre a 100 mg/mL ne prepari una figlia a 0,01 mg/mL, per la quale occorre avere a disposizione un matraccio tarato da 50 mL e un volume di metanolo di circa 50 mL che non so se hai a disposizione.
Dalla soluzione figlia prepari poi le soluzione di lavoro prelevando rispettivamente 1 - 0,75 - 0,5 - 0,25 mL, aggiungi i reattivi e porti ad un volume finale di 5 mL.
Se nelle celle evidenziate in giallo inserisci i dati di Abs che andrai a leggere, sono già impostate le formule per arrivare ai mg TPC/g estratto.

Sperando di aver capito bene il problema, ti auguro buon lavoro.

P.S. Per estratto, quello che hai pesato per fare la soluzione madre, intendi il vegetale di cui intendi determinare il TPC???
Ciao
Luisa

Dal laboratorio se ne usciva ogni sera, e più acutamente a fine corso, con la sensazione di avere “imparato a fare una cosa”;
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(Primo Levi)


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