Colorazione di Golgi (impregnazione cromo-argentica)

[ClaudioG.]

Salve a tutti

So che questo è un forum di chimica pieno di chimici, ma ogni tanto un po' di biologia non guasta  .

Ho realizzato, con l'aiuto dei laboratori della mia scuola (che mi hanno fatto preparare le soluzioni di bicromato di K e di nitrato di Ag), una colorazione sviluppata dal genio di Camillo Golgi, nel 1873, atta a visualizzare i neuroni nella loro interezza (pirenoforo, assoni e dendriti).

La colorazione è applicabile presumo ad ogni porzione di tessuto nervoso, e devo dire che il risultato è incredibilmente elegante.

Essa si basa sulla precipitazione del cromato di argento Ag2CrO4, di colore nero (in realtà è rosso-bruno, ma al microscopio appare nero) nel citoplasma neuronale. 

La grandiosità di questa tecnica è data dal fatto che tale precipitazione avviene solo in un numero limitato di neuroni, 'scelti' in modo apparentemente aleatorio (in realtà non si conosce la causa di questa casualità). Ciò permette di isolare una cellula nervosa, distinguendola dal groviglio del tessuto circostante. 

Inoltre, le cellule colorate lo sono completamente, ossia l'intero citoplasma è pieno di precipitato nero. Ciò consente di seguire, almeno in parte, il percorso delle varie diramazioni, nonché di distinguere l'assone dai dendriti. 

Questa metodologia è stata a lungo usata dagli istologi, e lo è ancora oggi con alcune modifiche (relative specialmente ai tempi di colorazione e al metallo usato, che può essere anche Hg).

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Riporto di seguito la procedura da me effettuata, ripresa -e leggermente modificata- dai seguenti link (in inglese):

http://www.scribd.com/doc/7280622/The-Go...ons#scribd

http://www.ihcworld.com/_protocols/speci.../golgi.htm

Materiale e reagenti

• formalina tamponata 10 % (formaldeide 4%), di quella per i reperti patologici   ;
  
• bicromato di potassio al 3 % m/V         ;
  
• nitrato di argento al 2 % m/V       ;
  
• tre recipienti in vetro richiudibili, di cui due se possibile in vetro ambrato, adatti per contenere i pezzi biologici in questione e i reattivi;
  
• pipette, carta da filtro e vetri da orologio (o piastre Petri); 
  
• cervello fresco (io ho usato un encefalo di agnello procuratomi dal macellaio) e materiale per dissezione (bisturi, pinzette e forbici bastano);
  
• se si vuole conservare il vetrino, materiale per montaggio vetrini (io ho usato glicerolo all'interno e smalto nero per i bordi del coprioggetto);
  
• vetrini porta- e coprioggetto e, ovviamente, microscopio biologico. 
  

Procedimento

Per effettuare la precipitazione si ricorre a due impregnazioni successive: la prima è l'immersione in bicromato di potassio al 3 % m/V, la seconda in nitrato di argento al 2 % m/V.

1. Si seziona il cervello, approfittandone per osservarne l'anatomia macroscopica. Si tolgono le meningi nelle aree di prelievo, e si tagliano dei blocchi di corteccia (comprendenti però sia materia bianca che grigia) di circa 5 x 10 mm^2, si sciacquano rapidamente in acqua distillata e si immergono subito in formalina, per essere fissati. 
   La fissazione preserva il tessuto dal deterioramento, e lo indurisce per il successivo sezionamento.
   
2. I pezzi devono rimanere in formalina per un tempo minimo di 24 h. Trascorso il tempo necessario, si prelevano e si immergono nella soluzione di K2Cr2O7 (possibilmente nel recipiente ambrato) per 3-7 giorni (io l'ho tenuto per 7 giorni). Il tutto va mantenuto al buio (si può avvolgere del foglio di Al intorno al contenitore), e la soluzione va cambiata con della nuova ogni giorno.
   
3. Si prelevano ora i pezzi e si asciugano brevemente sopra della carta da filtro. Io li ho sciacquati rapidamente in acqua distillata. Si immergono quindi nel secondo recipiente ambrato (o coperto direttamente da Al), contenente la soluzione di AgNO3. Si forma immediatamente un precipitato finemente disperso di cromato di argento, che rende torbida la soluzione. In base a ciò che ho potuto capire, infatti, il bicromato in soluzione è in equilibrio con gli ioni cromato, i quali reagendo con gli ioni argento, danno:
             CrO42- + 2 Ag+ Ag2CrO4
   
4. I pezzi vanno lasciati in nitrato di Ag per 1-3 giorni (io li ho tenuti per 2 giorni). A tal proposito le fonti usate non sono del tutto chiare, ma io ho sostituito due volte la soluzione, in modo che alla fine non contenesse più apprezzabili quantità di precipitato, benché i pezzi siano ricoperti in superficie da cromato di argento (e ciò credo vada bene). In ogni caso il recipiente va lasciato al buio.
      
   
5. Trascorso il tempo necessario si scelgono uno o due pezzi e si estraggono dal recipiente per metterli in una Petri con acqua distillata. Per sezionare occorrerebbe avere un microtomo serio, ma io non l'ho e ho usato una specie di microtomo di Ranvier autocostruito. In alternativa si può reggere fermamente il pezzo con le pinzette e tagliare. In ogni caso occorre munirsi di un bisturi molto affilato (farmacia) e di molta pazienza (non si vende ). Si consideri che lo spessore deve essere di circa 100 um (0,1 mm). Le sezioni vanno messe su un portaoggetti, appoggiate su una goccia di acqua distillata ciascuna.
   
         
   
6. Si osservano rapidamente le sezioni, senza coprioggetto (attenzione a non sporcare il 40 x, il 100 x non occorre usarlo), scartando le peggiori. [prestare molta attenzione per non far disidratare le sezioni: mantenerle sempre bagnate, perché se si seccano aderiscono al vetrino, si arrotolano e non si possono spostare] Le migliori si montano col coprioggetto. Nello specifico, non ho seguito la procedura di disidratazione delle fonti, essendo sprovvisto di etanolo 95 % e di xilene: ho semplicemente messo le sezioni migliori, asciugate con della carta assorbente, al centro del vetrino, poi ci ho messo sopra una o due gocce di glicerolo (glicerina) e ho coperto; non appena il coprioggetto si è livellato ho sigillato attentamente i bordi con dello smalto nero per unghie. Non so se reggerà a lungo, comunque con la glicerina si vede benissimo.  
   

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Le foto al microscopio le metterò nel prossimo messaggio, perché devo ancora scegliere le più chiare e perché ho ancora diversi pezzi da osservare   .
Spero di aver scelto la sezione adatta, ero indeciso tra questa e microscopia, ma ho scelto questa perché si tratta di biologia e tecniche istologiche, non propriamente di microscopi. Ovviamente si può spostare dove opportuno se occorre.

Saluti, Claudio.

[ClaudioG.]

Ecco scelte le micrografie migliori al momento. Più che le migliori direi le meno peggio, poiché non ho un raccordo serio per l'obiettivo fotografico, né ho trovato la fotocamera adatta (ho usato, come tra l'altro faccio da quando ho il microscopio, il mio cellulare retto dalla mia mano poco ferma   ). Comunque farò altre osservazioni più accurate quando avrò tempo, e se è il caso metterò le foto, che possono essere utili per un raffronto istologico con quelle di chi vorrà cimentarsi nella colorazione o semplicemente per un parere dei più esperti.
È inutile dirvi che vederlo al microscopio è tutt'altra cosa: i colori dell'impregnazione argentica non si prestano molto bene al mio metodo di raccolta fotografica (se così si può chiamare), specialmente per la presenza di una specie di superficie lucida che non permette di riprodurre al meglio il netto contrasto visibile negli oculari. Mi scuso quindi per alcune foto poco definite, ma è quanto di meglio sia riuscito a fare in poco tempo.

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Relativamente agli ingrandimenti ho usato obiettivi da 10 x, da 40 x e da 100 x, ma le varie foto sono state zoomate in modi diversi per motivi di chiarezza, quindi non è rintracciabile l'ingrandimento esatto (solo nella 4^ foto posso affermare che è circa 100 x -10*10x-). Le grosse ramificazioni diffuse sono capillari sanguigni. Credo di poter classificare alcuni neuroni visibili nelle foto a minore ingrandimento come neuroni piramidali, ma sulle cellule altamente ramificate sono abbastanza sicuro che siano degli astrociti protoplasmatici (facenti parte delle cellule della glia). Non è facile identificare i vari tipi cellulari, e chiedo ai più esperti un parere a proposito. Nel frattempo, per un raffronto visivo, inserisco questa immagine trovata sul web: 
   

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Segue una rivisitazione (suggerita da un mio amico) della precedente   :
   

Saluti, Claudio

[ClaudioG.]

Buongiorno
Per contrastare l'oziosa noia e calura estiva, pochi giorni fa ho pensato di ripetere la colorazione, stavolta su un cervello di coniglio. Dico subito che, mentre nella pecora non è difficile identificare -benché con approssimazione- le strutture cerebrali comparandole a quelle umane, nel coniglio lo è, almeno per me. Non ne conosco l'anatomia, per cui confesso di aver sezionato a caso .
La tecnica è la stessa, quindi aggiungo solo qualche foto.

       
       
   

Mi scuso di nuovo per la qualità delle foto, pessima, ma la tecnica fotografica è quella che è  . Inoltre, è difficilissimo beccare il neurone giusto, che abbia più ramificazioni possibili sullo stesso piano focale (i dendriti si diramano in ogni direzione, tridimensionalmente), quindi sono moltissime le cellule in cui era visibile solo il corpo cellulare che non ho fotografato. Consiglio a chiunque ne abbia possibilità (magari chi non ha un microscopio può fare la colorazione ed osservare con quello di scuola/università, facendo anche colpo sull'insegnante di biologia   ) e voglia di passar tempo di provare: è, secondo me, la tecnica istologica più entusiasmante ed elegante, ed è anche molto semplice (non richiede microtomi, basta mano ferma e un buon bisturi).

[zodd01]

Sembrano disegni rupestri di epoca preistorica.

[ClaudioG.]

Sembrano disegni rupestri di epoca preistorica.

È vero 
Ma i neuroni sono più belli 

[Vernixia]

Salve Claudio, ho notato che anche tu lavori con l'impregnazione Golgi cox. Io ultimamente ho dei problemi nella colorazione del cervello umano. Non riesco a far impregnare i neuroni. La Colorazione colora solo vasi e piccole fibre di astrociti. Utilizzo il tuo stesso protocollo a parte la percentuale di nitrato d'argento allo 0,75 %. Secondo te potrebbe essere quello il problema? 
grazie mille