Determinazione della concentrazione di proteine solubilizzate
È 1po' che non scrivo, e a questo giro, cambio 1po' argomento.

Avendo di questi tempi spesso a che fare con i prodotti della Bio-Rad, ed in particolare col kit per la determinazione della concentrazione di proteine solubili in campioni di composti che sintetizzo, volevo parlarvene. Anche se forse alcuni di voi già conosceranno questo test.
Esso è basato sul metodo proposto da Bradford, ed è una procedura semplice ed accurata per la determinazione della concentrazione di proteine solubilizzate. Consiste nell'aggiunta di un colorante acido alla soluzione contenente le eventuali proteine da testare, e nella successiva misura a 595 nm con uno spettrofotometro UV/vis. Il paragone con una curva fatta analizzando uno standard fornisce una misura relativa delle concentrazione di proteine.

Per chi non lo conoscesse, il saggio di Bradford è una procedura analitica strumentale per la determinazione del contenuto in proteine di un soluzione.
Dipende dalla composizione aminoacidica delle proteine misurate.
Prende il suo nome dallo scienziato Marion M. Bradford (Bradford MM (May 1976). "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding". Anal. Biochem. 72: 248–54).
Questo metodo è basato sullo shift in assorbanza del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 in cui in condizioni acide la forma rossa del colorante è convertita nella sua forma più blu per legarsi alla proteina da analizzare. Durante la formazione di questo complesso, avvengono due tipi di interazioni di legame: la forma rossa del colorante dona il suo elettrone libero ai gruppi ionizzabili della proteina, che causano una rottura dello stato nativo della proteina, di conseguenza esponendo le sue tasche idrofobiche. Queste tasche sulla struttura terziaria della proteina si legano in modo non covalente alla regione non polare del colorante attraverso forze di van der Waals, posizionando i gruppi amminici positivi in prossimità della carica negativa del colorante. Il legame è inoltre reso più forte dall'interazione ionica tra i due. Il legarsi della proteina stabilizza la forma blu del colorante; quindi la quantità del complesso presente in soluzione è una misura della concentrazione della proteina, e può essere stimato tramite l'uso della lettura di un'assorbanza.

[Immagine: Coomassie-Brilliant-Blue-Structure.gif]

La forma legata del colorante ha un massimo nelle spettro di assorbanza storicamente settato a 595 nm. La forme cationiche (non legate) sono verdi o rosse. Il legarsi del colorante alla proteina stabilizza la forma blu anionica. L'aumento in assorbanza a 595 nm è proporzionale alla quantità di colorante legato, e quindi alla quantità (concentrazione) di proteina presente nel campione.


Il saggio Bio-Rad per la determinazione proteica è un saggio che si basa appunto sulla capacità del colorante di legarsi alle proteine presenti in cui il diverso cambiamento di colore del colorante avviene in risposta a diverse concentrazioni di proteina1.
Il massimo in assorbanza per una soluzione acida del colorante Coomassie® Brilliant Blue G-250 varia da 465 nm a 595 nm quando avviene il binding con la proteina2,3,4.
Il colorante Coomassie blue si lega ai residui primari basici e agli amino acidi aromatici, specialmente all'arginina5.
Spector6 trovò che il coefficiente di estinzione molare di una soluzione di complesso colorante-albumina (BSA) era costante su un range di concentrazione di 10 volte. Perciò, le legge di Beer poteva essere applicata per una quantificazione accurata di proteina selezionando un appropriato rapporto tra volume di colorante e concentrazione del campione.
Le interferenze possono essere causate da interazioni tra composti chimici-proteina e/o composti chimici-colorante.
Ecco alcuni composti chimici che non interferiscono con tale saggio:

Acetato, 0.6 M
Acetone
Adenosina, 1 mM
Amino Acidi
Ammonio solfato, 1.0 M
Amfoliti, 0.5%
pH acido
ATP, 1 mM
Barbitale
BES, 2.5 M
Acido borico
Cacodilato-Tris, 0.1 M
CDTA, 0.05 M
Citrato, 0.05 M
Deossicolato, 0.1%
Ditiotreitolo, 1 M
DNA, 1 mg/ml
EDTA, 0.1 M
EGTA, 0.05 M
Etanolo
MEM di Eagle
Soluzione di sale di Earle
Acido formico, 1.0 M
Fruttosio
Glucosio
Glutatione
Glicerolo, 99%
Glicina, 0.1 M
Guanidina-HCl
Soluzione del sale di Hank
Tampone HEPES, 0.1 M
KCl, 1.0 M
Acido malico, 0.2 M
MgCl2, 1.0 M
Mercaptoetanolo, 1.0 M
MES, 0.7 M
Metanolo
MOPS, 0.2 M
NaCl, 5 M
NAD, 1 mM
NaSCN, 3 M
Peptoni
Fenolo, 5%
Fosfato, 1.0 M
PIPES, 0.5 M
Acido poliadenilico, 1 mM
Polipeptidi (MW < 3000)
Pirofosfato, 0.2 M
rRNA, 0.25 mg/ml
tRNA, 0.4 mg/ml
RNA totale, 0.30 mg/ml
SDS, 0.1%
Sodio fosfato
Streptomicina solfato, 20%
Triton X-100, 0.1%
Tricina
Tirosina, 1 mM
Timidina, 1 mM
Tris, 2.0 M
Urea, 6 M
Vitamine

Notare: I tamponi basici e i detergenti interferiscono con questo saggio.

Dato che qualsiasi combinazione proteina-reagente chimico non è stata testata, è possibili che alcune della combinazioni elencate produca interferenza in combinazione con alcune proteine.
Comunque, rispetto alle proteine come la BSA e l'IgG, i reagenti elencati mostrano piccola o nessuna interferenza. Le concentrazioni accettabili sono quelle elencate sopra. Le concentrazioni equivalenti per i microsaggi sono 1/40 di quelle elencate in tabella, a causa della differenza sperimentale tra i due saggi.

Per tale saggio è necessario in primis il reagente concentrato (450 mL di soluzione contenente il colorante, acido fosforico, metanolo) e gli standard (BSA e IgG); poi sono necessari uno spettrofotometro, settato su 595 nm, cuvette con cammino ottico di 1cm (in quarzo o in materiale plastico), Eppendorf o simili in cui preparare il campione, Vortex mixer, pipette in grado di erogare da 50 μL a 800 μL.

Per ricostruire gli standard liofilizzati, aggiungere 20 mL di acqua deionizzata e miscelare fino a dissoluzione completa. Se lo standard non dovesse essere usato in 60 giorni, andrebbe diviso in aliquote e congelato a -20 °C.

Nel mio caso ho effettuato dei microsaggi, quindi andrò a parlarvi di questi.

1. Preparare da tre a cinque diluizioni di standard che è rappresentativo della soluzione di proteina da testare. Il range lineare del saggio per la BSA è 1.2 - 10.0 μg/mL, mentre con la IgG è 1.2 - 25 μg/mL.

2. Pipettare 800 μL di ogni standard e di ogni campione in una provetta da test pulita, asciutta. Le soluzione della proteina sono di norma saggiata in duplicato o triplicato.

3. Aggiungere 200 μL di colorante reagente concentrato ad ogni provetta e vortexare.

4. Incubare a t.a. per almeno 5 minuti. L'assorbanza aumenterà col tempo; i campioni andrebbero incubati a t.a. per non più di 1 ora.

5. Misurare l'assorbanza a 595 nm.

Purtroppo non ho foto in quanto il lavoro che svolgo è secretato, in quanto brevettabile. Mi dispiace.

PS: Ho una domanda per voi. Quando lavo le provette con acqua del rubinetto l'acqua si colora di blu, sapreste dirmi il perché? I miei capi dicono che non è perché il colorante è blu... Grazie.


Riferimenti
1. Bradford, M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976).
2. Reisner, A. H., Nemes, P. and Bucholtz, C., Anal. Biochem., 64, 509 (1975).
3. Fazakes de St. Groth, S. et al., Biochim. Biophys. Acta, 71, 377 (1963).
4. Sedmack, J. J. and Grossberg, S. E., Anal. Biochem., 79, 544 (1977).
5. Compton, S. J. and Jones, C. G., Anal. Biochem., 151, 369 (1985).
6. Spector, T., Anal. Biochem., 86, 142 (1978).
7. Duhamel, R. C., Meezan, E. and Brendal, K., J. Biochem. Biophys. Methods, 5, 67 (1981).
8. Macart, M. and Gerbaut, L., Clin. Chim. Acta, 122, 93 (1982).
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Mario, rock.angel, thenicktm
Mi chiedo: perché non dovrebbe essere il colorante?
Credo di aver formulato sabato a pranzo una brillante e complessa teoria a riguardo (che però non ricordo più) ma secondo me è molto più semplice: il colorante in questione è rimasto almeno in tracce nella provetta, e quando te la lavi con acqua, si forma una soluzione acqua+colorante a pH intorno al 7; visto che il colorante tra pH maggiore di 2 e pH 7 ha colore blu, la tua soluzione diventa blu. Prova, quando rifai i test, a buttare nella provetta prima due gocce di NaOH e poi aggiungi acqua per lavare... a quel punto il pH è basico e la soluzione dovrebbe essere tendente al rosa! Se resta blu non è il colorante a dare il colore blu!

http://www.carlroth.com/website/de-ch/pd...ssie_E.pdf

E poi domanda: perché l'incubazione non deve essere prolungata per più di 1 ora a t.a.? Si destabilizza il legame colorante-proteina e quindi l'assorbanza diminuisce?
oO° elena [pink_chemist] °Oo
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quimico
Grazie della risposta. Non appena avrò l'occasione testerò questa tua idea.

L'incubazione non deve essere prolungata nel tempo perché il campione si deteriora in queste condizioni di analisi. Prima si esegue l'analisi migliore sarà la lettura, lettura che già in alcuni casi inizia da subito ad oscillare. Nella maggior parte dei casi comunque si riesce ad avere un valore medio sufficiente per determinare la % della proteina presente. È anche il motivo per cui si fanno queste analisi in doppio o in triplo.
Penso che tale cosa si dovuta alla natura acida del colorante e alla sua capacità di binding verso la proteina (BSA nel mio caso). È un sistema molto sensibile.
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