Determinazione quantitativa di glicosaminoglicani
I glicosaminoglicani (GAGs) sono polisaccaridi lineari composti da disaccaridi che contengono esosamine ripetute e che sono solfatati a diversi gradi. La maggior parte delle cellule animali sintetizzano diversi tipi di GAGs tra cui l'eparan solfato (HS), la condroitina solfato (CS), il dermatan solfato (DS), il cheratan solfato (KS), e lo ialuronano o acido ialuronico (HA). HS, CS, e DS sono assemblati sul nucleo proteoglicanico delle proteina nell'apparato del Golgi attravero la connessione di tetrasaccaridi (GlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser). KS è assemblato su un nucleo specifico di proteine attraverso oligosaccaridi N-linkati (KSI) o O-linkati (KSII). HA è unico in quanto non è solfatato ed è direttamente secreto senza un nucleo della proteina nello spazio extracellulare.

HA ed HS sono costituiti da unità ripetute dei disaccaridi GlcNAc e GlcA mentre KS è composto da un'alternanza tra N-acetil glucosamina (GlcNAc) e galattosio. CS sono costituiti dall'alternarsi di GalNAc e GlcA/IdoA. Essi sono classificati come tipi di CS tramite le lettere A, B, C, D, ed E a seconda della forma del disaccaride predominante. I CS isolati da tessuti animali di solito comprendono un tipo principale di disaccaride che si ripete, ma contengono sempre specie minori di altri disaccaridi. DS, anche noto come CS-B, è distinto da altre varietà di CS tramite il suo elevato contenuto di residui IdoA e dalle sue uniche proprietà anticoagulanti [1].

Il più studiato GAG, l'eparina, è un eparan solfato supersolfatato prodotto dai mastociti. L'eparina è usata clinicamente come farmaco anticoagulante ma possiede anche proprietà antisettiche [2], antiaboartive (aborto spontaneo) [3], antiinfiammatorie mediate da selettina, anticistitiche interstiziali, ed antitumorali verso le metastasi [4–8]. L'eparina commerciale è espressa come unità/mg di attività anticoagulante in quanto sia la sua purezza che la sua qualità sono difficili da controllare. Anche CS e glucosamina sono di interesse clinico, raggiungendo il terzo posto tra i composti nutriceutici più venduti negli USA come supplemento nel trattamento della osteoartrite [9].

La maggior parte delle funzioni biologiche possono essere monitorate direttamente tramite il loro impatto sui GAGs dato che miglialia di proteine interagiscono coi GAGs [10]. I GAGs sono direttamente coinvolti in molte vie metaboliche di segnalazione [11]. Inoltre, la biosintesi di un GAG è regolata da una varietò di chemochine, citochines, e fattori di crescita [12,13]. Quindi, metodi per quantificare i GAG che siano semplici, sensibili, e robusti sono necessari per lo sviluppo di biomarker.

I GAGs possono essere quantificati ed analizzati tramite NMR [14], MS [15], LC-MS [16], HPLC in fluorescenza enzimatica post colonna [17], metodi elettroforetici [18], e attraverso metodi più generali per l'analisi della composizione in monosaccaridi come la cromatografia a scambio anionico ad alte prestazioni (HPAEC) con rilevatore amperometrico pulsato (PAD) [19]. Comunque, è necessario un metodo di quantificazione semplice, diretto, sensibili, e robusto per la quantificazione di routine di un GAG.

Tra i tanti metodi vorrei citarvi quello che fa uso del carbazolo.
Il saggio con carbazolo è basato sulla reazione colorimetrica quantitativa dipendente dalla concentrazione tra carbazolo e acido uronico e può essere affidabile quanto un'analisi all'HPLC per quantificare il contenuto in acido uronico nei GAGs [21,22]. Comunque, tale saggio non puà rilevare KS, che non possiede residui di acido uronico. Si è anche notato che la contaminazione da NaCl genera segnali che sono falsi positivi. Quindi, è essenziale che i campioni da analizzare debbano essere senza sali. Inoltre pare che il saggio con carbazolo sovrastimi la concentrazione per i GAGs che sono stati sottoposti a cromatografia ad esclusione in un tampone contenente sale (Zhang L.). Dato che filtrazione di gel è una comune via per ottenere frammenti oligosaccaridici di GAG biologicamente attivi, la rimozione dei sali prima del saggio col carbazolo deve essere inclusa per ottenere una quantificazione accurata del GAG. In maniera interessante, Bitter e Muir hanno anche riportato che il saggio col carbazolo è sensibile al glucosio, e che alcuni tipi di segnali attribuiti ad un GAG sono sensibili agli ioni cloruro [21]. La validità di tale saggio è largamente dipendente dalla purezza del GAG.

La sensibilità del saggio in questione può essere resa anche 5 volte più elevata rispetto ai saggi convenzionali [21,22] a causa della riduzione del volume di reazione (5 volte minore). Può rilevare fino a 1.25nmol (1.25nmol × 194 = 243ng) di GlcA che produce un segnale di assorbanza di 0.040±0.002 unità sopra il background. In contrasto, il metodo convenzionale consuma ~ 2–5µg di GAGs. Cesaretti et al. hanno anche miniaturizzato tale saggio ed hanno adottato lo stesso volume di reazione usato in questo caso, ma in un formato particolare [29]. Sorprendentemente, la sensibilità del loro saggio è identica a quella del saggio convenzionale fatto in una provetta, cioè 1µg per GlcA e 3µg per i GAGs.

[Immagine: bradford-colorimetric-assay-1.jpg]

La quantificazione basata sul carbazolo comporta due passaggi:
1) idrolisi dei GAGs con sodio tetraborato 0.025M in acido solforico a dare acido uronico e glicosamina;
2) reazione colorimetrica tra acido uronico e carbazolo.
Entrambe le razioni richiedono una bollitura per 10 min.
Una provetta in Pyrex con tappo a vite contenente 3.6mL di reagenti è usata per questo saggio. Per la quantificazione del GAG, sono necessari almeno due duplicati di campione da ~5µg per ogni GAG incognito.
Il perché di un volume minore rispetto al solito è presto spiegato: se si scala il volume di reazione, è logico pensare che lo stesso quantitativo di GAGs generi colori più concentrati, aumentando quindi la sensibilità del saggio.

Si utilizza un bagno termostatato settato a 100°C sia per l'idrolisi sia per la reazione con il carbazolo. I reagenti usati sono una soluzion 0.025M di sodio tetraborato decaidrato in acido solforico ed una soluzione allo 0.125% di carbazolo in EtOH assoluto (W/V).
Aggiungere 200µl della soluzione borace+ac. solforico a 40µl di una soluzione del GAG o acqua (bianco). Le provette sono tappate e vortexate velocemente.
Scaldare per 15 min a 100°C e quindi raffreddare a 4°C.
Ad ogni provetta, aggiungere 8µl della soluzione etanolica del carbazolo e vortexare quindi velocemente.
Scaldare per 15 min a 100°C e quindi raffreddare a 4°C.
I campioni sono stati vortexati e 200µl di ogni campione viene trasferito in una cuvetta.
Misurare l'assorbanza a 530nm.
La GlcA è stata usata come standard esterno, e la curva degli standard è stata derivata mettendo in grafico assorbanza vs. concentrazione di GlcA o standard del GAG.
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Riferimenti

1. Toleffsen DM, Zhang L. In: Hemostasis and Thrombosis. Colman RW, editor. Lippincott Williams & Wilkins; 2006. pp. 271–283.

2. Robertson MS. Heparin: the cheap alternative for immunomodulation in sepsis? Crit Care Resusc. 2006;8:235–238.
3. Girardi G. Heparin treatment in pregnancy loss: Potential therapeutic benefits beyond antigcoagulation. J Reprod Immunol. 2005;66:45–51.

4. Chancellor MB, Yoshimura N. Treatment of interstitial cystitis. Urology. 2004;63:85–92.

5. Falanga A. The effect of anticoagulant drugs on cancer. J Thromb Haemost. 2004;2:1263–1265.

6. Gao Y, Li N, Fei R, Chen Z, Zheng S, Zeng X. P-Selectin-mediated acute inflammation can be blocked by chemically modified heparin, RO-heparin. Mol Cells. 2005;19:350–355.

7. Varki NM, Varki A. Heparin inhibition of selectin-mediated interactions during the hematogenous phase of carcinoma metastasis: rationale for clinical studies in humans. Semin Thromb Hemost. 2002;28:53–66.

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10. Conrad HE. Heparin-Binding Proteins. San Diego: Academic Press; 1998.

11. Bishop JR, Schuksz M, Esko JD. Heparan sulphate proteoglycans fine-tune mammalian physiology. Nature. 2007;446:1030–1037

12. Godden JL, Edward M, MacKie RM. Melanoma cell-derived facter stimulation of fibroblast glycosaminoglycan synthesis—the role of platelet-derived growth facter. Eur J Cancer. 1999;35:473–480.

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15. Saad OM, Leary JA. Compositional analysis and quantification of heparin and heparan sulfate by electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 2003;75:2985–2995.

16. Kuberan B, Lech M, Zhang L, Wu ZL, Beeler DL, Rosenberg RD. Analysis of heparan sulfate oligosaccharides with ion pair-reverse phase capillary high performance liquid chromatography-microelectrospray ionization time-of-flight mass spectrometry. J Am Chem Soc. 2002;124:8707–8718.

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29. Cesaretti M, Luppi E, Maccari F, Volpi N. A 96-well assay for uronic acid carbazole reaction. Carbohydr Polym. 2003;54:59–61.
Sensa schei né paura ma coa tega sempre dura
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