LOD e LOQ metodo analitico
A lavoro mi han chiesto di verificare il limite di rivelabilità (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) inferiore e superiore per una serie di metodi analitici spettrofotometrici per la determinazione di nutrienti nelle acque.

Siccome ho qualche dubbio sulla bontà del lavoro svolto, scrivo qui come ho operato, magari potete dare le conferme o dei suggerimenti per migliorare. Innanzitutto, sono cose che ho studiato molti anni fa e quindi ho seguito una guida per determinare questi parametri.


Prendiamo un caso specifico, la determinazione spettrofotometrica dell'ammoniaca per reazione con salicilato sodico in ambiente basico.
La procedura che ho trovato suggerisce almeno 10 misurazioni ripetute di campioni bianchi, da cui calcolare lo scarto tipo.
Qui il mio primo dubbio, perchè la guida non è chiara e non ho ben capito se intende 10 misurazioni indipendenti dello stesso medesimo bianco oppure se si devono misurare 10 bianchi diversi preparati alla stessa maniera (che quindi differiscono solamente per quegli errori dovuti all'operatore e all'incertezza associata alla vetreria utilizzata), una misurazione per bianco, per un totale di 10 valori da cui calcolare lo scarto tipo. 
Da una parte mi verrebbe da dire la seconda, perchè il rischio altrimenti sarebbe quello di avere uno scarto tipo veramente troppo prossimo allo zero, e quindi un LOD e un LOQ decisamente sottostimati. Però la procedura di misura prevede la correzioni delle assorbanze dei campioni per un singolo bianco, quindi questo invece mi induce a pensare alla prima ipotesi.
Altra cosa: il nostro spettrofotometro UV-Vis è dotato di carrellino  mobile, con quattro posizioni di misura per cuvette da 1 cm di cammino ottico. Siccome nella pratica si utilizza il carrellino con tutte le sue posizioni e lo si muove (non è che si utilizza una singola cuvetta ogni volta e la si ripulisce prima di metterci la nuova soluzione), ho cercato le 4 cuvette più simili possibile tra di loro (che messe vuote dentro lo spettrofotometro avessero gli assorbimenti più simili possibile tra di loro e comunque le riempio col bianco (o i bianchi), in modo da considerare anche l'errore associato all'eventuale utilizzo di cuvette non proprio identiche.
Sempre su questo, ho ancora un dubbio: siccome i dati su cui calcolare lo scarto tipo sono nel dominio della risposta strumentale ma io voglio un valore di concentrazione (che è quello che ci interessa per il LOD e il LOQ), prima di effettuare lo scarto tipo trasformo i 10 valori di assorbanza ottenuto sul bianco (o i bianchi?) in valore di concentrazione utilizzando l'equazione che hop trovato nel range di linearità del metodo durante la taratura. Siccome siamo interessati al valore di concentrazione di analita che dia un segnale che si possa dire essere con una certa fiducia distinguibile dalla media del segnale bianco, quando faccio le misurazioni dei bianchi, conviene prendere il bianco con una cuvette vuota e correggere i valori dei bianchi procedurali per il bianco della cuvetta vuota, in modo da avere l'asssorbanza della sola matrice bianca senza l'influenza della cuvetta?

Comunque, dai miei valori di concentrazione ottenuti delle assorbenze del bianco calcolo lo scarto tipo, lo correggo con una certa formula (che dipende da quante misurazioni per ogni campione e quante correzioni per il bianco la procedura raccomanda, per esempio se si dice che basta misurare ogni campione di prova una singola volta e tutti i campioni vanno corretti per lo stesso identico bianco, si moltiplica lo scarto tipo per radice di 2 per ottenere lo scarto tipo corretto), e moltiplico lo scarto tipo corretto per 3 per avere il LOD nel dominio delle concentrazioni. 
Per LOQ (inferiore, il punto in cui comincia la relazione lineare tra concentrazione di analita e risposta strumentale), si moltiplica lo scarto tipo corretto per 10. Almeno , la IUPAC raccomanda 10 come caso generale e di ampia applicabilità, ma si possono utilizzare anche altri fattori moltiplicativi tipo 5 o 6 a seconda dei casi. Io ho utilizzato 10, ma quel cagacazzo del mio capo vuole pure sapere la ragione per cui ho utilizzato 10 e non 5 o 6. Io mi son messo di buona volontà e ho trovato il Gold Book (o era l'Orange Book, boh) della IUPAC, ma li si entra in una trattazione matematica e statistica per affrontare la quale non ho le competenze senza perderci tutto il mio tempo libero e la sanità mentale.

Per il LOQ superiore (la concentrazione più alta alla quale la dipendenza della risposta strumentale è ancora lineare) ho semplicemente preso il range di applicabilità fornito dalla procedura analitica seguita, e ho preparato una serie di soluzioni di taratura a titolo noto equidistanti tra di loro all'interno del range indicato, più una meno concentrata della minima concentrazione indicata e una più concentrata della massima concentrazione indicata (entrambi i casi del 20%). Questo per verificare se con il nostro strumento e le nostre celle il range è lo stesso. Quindi verifico sperimentalmente il LOQ inferiore determinato con la formula di prima. Se la risposta è ancora lineare alla massima concentrazione, proseguo a fare soluzioni più concentrate facendone tante intorno al punto di presunta fine di dipendenza lineare. Questo mi permette di determinare gli estremi del range di linearità nel mio caso, che può essere diverso da quello indicato dalla procedura analitica che ha un senso solo generale.
Per verificare la bontà della regressione lineare, ho infine calcolato i residui (la differenza tra i valori di risposta forniti dallo strumento e quelli calcolati con l'equazione della retta di taratura) e guardato la loro distribuzione intorno allo zero: se si distribuiscono casualmente  sopra e sotto lo zero, ci sono solo errori casuali e la linearità è buona, se c'è un andamento (quasi tutti i punti sopra lo 0 o sotto lo 0) ci sono errori sistematici e la linearità non è buona.


Scusate il papiro infinito, sono stato prolisso e la tematica non è nemmeno delle più divertenti, anzi.
Però se qualcuno potesse darmi un'opinione sulla bontà del mio approccio, darmi dei suggerimenti e rispondere ai mie dubbi, gliene sarei molto grato.

Grazie.
Cita messaggio
Analizzando 10 volte lo stesso campione bianco ottieni un LOD/LOQ solo strumentale che non dipende della procedura. Se analizzi 10 campioni bianchi diversi ottieni un più utile LOD/LOQ del metodo.

Senza l’influenza della cuvette? Non credo proprio.

Assumere 10 è arbitrario quanto assumere 5 o 6, a meno che non sia la Legge a stabilirlo.
Cita messaggio
Ok, grazie mille, anch'io pensavo fosse più utile preparare 10 bianchi e prendere un valore per bianco.

Mi spiego meglio cosa intendo quando dico "senza cuvetta".
Quando si costruisce la retta di taratura con le soluzioni a titolo noto dell'analita che si vuole determinare, azzero lo strumento con una cuvetta con il bianco (nel mio caso, acqua distillata con aggiunta di soluzione di nitroprussiato sodico + salicilato sodico e aggiunta di soluzione basico per NaOH di citrato sodico + dicloroisocianurato). Se c'è ammonio, la soluzione diventa verde-blu con intensità che dipende dalla concentrazione di ammonio. Se non c'è ammonio (bianco) diventa solo gialla. Quindi a 690 nm (lunghezza d'onda alla quale devo leggere l'assorbanza) anche il bianco ha un suo, minimo assorbimento, e io faccio in modo che l'assorbanza del bianco sia 0, così che la retta di taratura passi per l'origine.

Ora, quando faccio le analisi ripetute dei bianchi per determinare il LOD/LOQ della procedura, bisogna tenere conto che ho 10 valori di risposta strumentale da cui determinare la deviazione standard. La deviazione standard è quindi espressa nel dominio della risposta strumentale, non delle concentrazioni, che è quello a cui sono più interessato. 
Quando si ottengono i valori di assorbanza per la curva di taratura, questi sono valori netti che dipendono solo dalla quantità di ammoniaca, perchè l'assorbanza di cuvetta + soluzione contenente ammoniaca, solvente e reattivi è corretta per l'assorbanza di cuvetta + solvente e reattivi. Quindi, se io voglio sapere qual è il valore di concentrazione di ammoniaca così basso da fornire un segnale non distinguibile da quello della matrice bianca (o meglio, oltre al quale si può dire che comincia a distinguersi), pensavo che ci si debba rifare al segnale netto della matrice bianca, quindi quello che ho fatto è mettere una cuvetta vuota, azzerare lo strumento e poi inserire le cuvette con le soluzioni bianche per prendere i 10 valori di assorbanza netti. Utilizzo poi l'equazione della retta per trasformare queste 10 assorbanze in 10 concentrazioni, calcolo lo scarto tipo e da questo LOD/LOQ procedurale.

Ma magari mi sbaglio ed è più corretto non fare alcun azzeramento.
Cita messaggio
OK, ma l'azzeramento del bianco con cuvetta vuota lo fai normalmente durante le analisi?
Non credo.
Cita messaggio




Utenti che stanno guardando questa discussione: 1 Ospite(i)