2017-11-03, 22:21 (Questo messaggio è stato modificato l'ultima volta il: 2017-11-04, 07:37 da ohilà.)
Pur avendo pochissima esperienza in questo settore, ho voluto tentare una reazione biochimica.
Non è riuscita pienamente, ma spero che possa risultare interessante comunque.
Il meccanismo enzimatico della reazione non è troppo semplice, soprattutto per un profano come me. Per una spiegazione dettagliata leggete la bellissima discussione di ClaudioG:
Aspetti biochimici della biosintesi del R-fenilacetilcarbinolo
Si tratta della conversione della benzaldeide in R-(+)-fenilacetilcarbinolo, noto come L-PAC, ad opera degli enzimi prodotti da varie specie di lieviti. Ho utilizzato il comune lievito di birra, il Saccharomyces Cerevisiae.
Questa è una biotrasformazione di grande interesse industriale, perché è alla base della produzione di molti farmaci di tipo fenilpropanolamminico.
MATERIALE
- Lievito di birra liofilizzato (Saccharomyces Cerevisiae)
- Attivante per lieviti (tiamina e sali d'ammonio)
- Saccarosio
- Solfato di magnesio
- Acido fosforico
- Benzaldeide
- Etanolo
- Acetone
- Esano ed etilacetato (o simili)
PROCEDURA
Disciogliere 85 grammi di saccarosio in un litro d'acqua utilizzando un recipiente di vetro molto sovradimensionato che fungerà da fermentatore. Aggiungere circa 85 grammi di frutta frullata per formire i necessari nutrienti al lievito. Ho usato un frullato di mela e banana (
).
L'ideale sarebbe utilizzare direttamente melassa nera, ma non si trova molto facilmente e comunque costa più di quanto dovrebbe...
Portare il pH a circa 5-5,5 con acido fosforico diluito, aggiungere 2 grammi di solfato di magnesio idrato, che necessita all'attività catalitica del principale enzima coinvolto. Aggiungere anche 25 grammi di comune attivante per lieviti, costituita da una miscela di sali d'ammonio (azoto prontamente assimilabile) e tiamina, una vitamina anch'essa fondamentale all'attività enzimatica.
Reidratare 70 grammi di lievito liofilizzato Saccharomyces Cerevisiae lasciandolo in poca acqua a 35-40°C, con un grammo circa di saccarosio, per una mezz'ora. Inocularlo nella miscela.
Far fermentare per 10 ore a temperatura ambiente sotto un'agitazione magnetica molto leggera. Inizialmente si ha un abbondantissimo schiumeggiamento che bisogna tenere sotto controllo. La miscela può aumentare anche tre o quattro volte il suo volume originario e può essere necessario travasarla momentaneamente in un recipiente più grande.
Aggiungere 0,7 ml di acetone.
Aggiungere una soluzione di 25 grammi di benzaldeide, 15 ml di etanolo e 1,5 ml di acetone a piccole porzioni (1/16 del totale), ogni mezz'ora.
E' bene effettuare le aggiunte di aldeide molto lentamente poiché il Saccharomyces Cerevisiae è avvelenato da concentrazioni eccessive di benzaldeide.
Oltre 2,1 g/l è inibita la crescita del lievito e a 3 g/l inizia la morte cellulare.
Dopo otto ore, terminate le aggiunte, continuare a far fermentare per quattro ore, sempre sotto cauta agitazione magnetica.
Spegnere l'agitatore e aspettare altre due o tre ore per far decantare il lievito, che altrimenti è quasi impossibile da filtrare.
Recuperare quanto più surnatante possibile e filtrare al meglio la sospensione rimanente.
Non si ottiene una soluzione del tutto limpida, ma non è un problema...
Estrarre prima con una porzione da 200 ml di esano, poi con 200 ml di etile acetato e infine con 200 ml di una miscela al 50% di etile acetato ed esano.
Riunire le frazioni di solvente, lavare prima con 150 ml di soluzione di sodio bicarbonato al 10% e poi con 100 ml di acqua. Distillare via il solvente.
Il residuo è un liquido limpido leggermente giallino, che si è dimostrato essere una miscela del prodotto desiderato e di una certa quantità di benzaldeide non reagita.
Una TLC, eluita con esano/etilacetato 7/3, mostra a sinistra la fase acquosa dopo l'estrazione, al centro uno standard di benzaldeide e, a destra il prodotto ottenuto. E' stata analizzata agli UV e poi trattata con acido solforico
Il cromatogramma non è eccellente, ma rende bene l'idea della situazione.
La parte più problematica è la purificazione del prodotto ottenuto dalla benzaldeide non reagita.
Il miglior modo per purificare il fenilacetilcarbinolo, ed anche l'unico che rimuove totalmente l'aldeide residua, è la distillazione sotto vuoto. E' efficace, ma molto tediosa, anche la cromatografia su colonna.
Per ora non sono del tutto attrezzato per nessuna delle due opzioni. Vi faremo sapere con Claudio se ci saranno sviluppi.
L'addotto tra composti carbonilici e bisolfito non credo che sia selettivo per separare aldeidi e chetoni. Anche la distillazione a pressione normale, visti gli alti p.eb. non sembra praticabile. Stessa cosa per la corrente di vapore e il congelamento frazionato.
Altrimenti si potrebbero variare le condizioni sperimentali per evitare che rimanga aldeide non reagita, ma non mi è chiarissimo come procedere.
Benvenuti eventuali suggerimenti.
Non è riuscita pienamente, ma spero che possa risultare interessante comunque.
Il meccanismo enzimatico della reazione non è troppo semplice, soprattutto per un profano come me. Per una spiegazione dettagliata leggete la bellissima discussione di ClaudioG:
Aspetti biochimici della biosintesi del R-fenilacetilcarbinolo
Si tratta della conversione della benzaldeide in R-(+)-fenilacetilcarbinolo, noto come L-PAC, ad opera degli enzimi prodotti da varie specie di lieviti. Ho utilizzato il comune lievito di birra, il Saccharomyces Cerevisiae.
Questa è una biotrasformazione di grande interesse industriale, perché è alla base della produzione di molti farmaci di tipo fenilpropanolamminico.
MATERIALE
- Lievito di birra liofilizzato (Saccharomyces Cerevisiae)
- Attivante per lieviti (tiamina e sali d'ammonio)
- Saccarosio
- Solfato di magnesio
- Acido fosforico
- Benzaldeide
- Etanolo
- Acetone
- Esano ed etilacetato (o simili)
PROCEDURA
Disciogliere 85 grammi di saccarosio in un litro d'acqua utilizzando un recipiente di vetro molto sovradimensionato che fungerà da fermentatore. Aggiungere circa 85 grammi di frutta frullata per formire i necessari nutrienti al lievito. Ho usato un frullato di mela e banana (
). L'ideale sarebbe utilizzare direttamente melassa nera, ma non si trova molto facilmente e comunque costa più di quanto dovrebbe...
Portare il pH a circa 5-5,5 con acido fosforico diluito, aggiungere 2 grammi di solfato di magnesio idrato, che necessita all'attività catalitica del principale enzima coinvolto. Aggiungere anche 25 grammi di comune attivante per lieviti, costituita da una miscela di sali d'ammonio (azoto prontamente assimilabile) e tiamina, una vitamina anch'essa fondamentale all'attività enzimatica.
Reidratare 70 grammi di lievito liofilizzato Saccharomyces Cerevisiae lasciandolo in poca acqua a 35-40°C, con un grammo circa di saccarosio, per una mezz'ora. Inocularlo nella miscela.
Far fermentare per 10 ore a temperatura ambiente sotto un'agitazione magnetica molto leggera. Inizialmente si ha un abbondantissimo schiumeggiamento che bisogna tenere sotto controllo. La miscela può aumentare anche tre o quattro volte il suo volume originario e può essere necessario travasarla momentaneamente in un recipiente più grande.
Aggiungere 0,7 ml di acetone.
Aggiungere una soluzione di 25 grammi di benzaldeide, 15 ml di etanolo e 1,5 ml di acetone a piccole porzioni (1/16 del totale), ogni mezz'ora.
E' bene effettuare le aggiunte di aldeide molto lentamente poiché il Saccharomyces Cerevisiae è avvelenato da concentrazioni eccessive di benzaldeide.
Oltre 2,1 g/l è inibita la crescita del lievito e a 3 g/l inizia la morte cellulare.
Dopo otto ore, terminate le aggiunte, continuare a far fermentare per quattro ore, sempre sotto cauta agitazione magnetica.
Spegnere l'agitatore e aspettare altre due o tre ore per far decantare il lievito, che altrimenti è quasi impossibile da filtrare.
Recuperare quanto più surnatante possibile e filtrare al meglio la sospensione rimanente.
Non si ottiene una soluzione del tutto limpida, ma non è un problema...
Estrarre prima con una porzione da 200 ml di esano, poi con 200 ml di etile acetato e infine con 200 ml di una miscela al 50% di etile acetato ed esano.
Riunire le frazioni di solvente, lavare prima con 150 ml di soluzione di sodio bicarbonato al 10% e poi con 100 ml di acqua. Distillare via il solvente.
Il residuo è un liquido limpido leggermente giallino, che si è dimostrato essere una miscela del prodotto desiderato e di una certa quantità di benzaldeide non reagita.
Una TLC, eluita con esano/etilacetato 7/3, mostra a sinistra la fase acquosa dopo l'estrazione, al centro uno standard di benzaldeide e, a destra il prodotto ottenuto. E' stata analizzata agli UV e poi trattata con acido solforico
Il cromatogramma non è eccellente, ma rende bene l'idea della situazione.
La parte più problematica è la purificazione del prodotto ottenuto dalla benzaldeide non reagita.
Il miglior modo per purificare il fenilacetilcarbinolo, ed anche l'unico che rimuove totalmente l'aldeide residua, è la distillazione sotto vuoto. E' efficace, ma molto tediosa, anche la cromatografia su colonna.
Per ora non sono del tutto attrezzato per nessuna delle due opzioni. Vi faremo sapere con Claudio se ci saranno sviluppi.
L'addotto tra composti carbonilici e bisolfito non credo che sia selettivo per separare aldeidi e chetoni. Anche la distillazione a pressione normale, visti gli alti p.eb. non sembra praticabile. Stessa cosa per la corrente di vapore e il congelamento frazionato.
Altrimenti si potrebbero variare le condizioni sperimentali per evitare che rimanga aldeide non reagita, ma non mi è chiarissimo come procedere.
Benvenuti eventuali suggerimenti.
![[-]](https://www.myttex.net/forum/images/collapse.png)
Bel lavoro! 
