Reazione di Liebermann-Burchard per la ricerca del colesterolo

Non spendo parole sul colesterolo perchè quimico ne aveva già parlato (http://myttex.net/forum/Thread-Steroidi?highlight=steroidi) sicuramente in maniera più accurata di quanto potrei fare io. Lascio al solito alla fine le considerazioni Reagenti: -Anidride acetica -Cloroformio -Acido solforico concentrato -Una fonte di colesterolo (ad es. un tuorlo d'uovo sodo). Procedura: Il tuorlo sodo di un uovo viene posto in un mortaio e miscelato con 25mL di cloroformio: in questo modo gran parte del colesterolo, insieme ad altre sostanze, si solubilizzerà nel solvente alogenato.

Si procede alla filtrazione, per ottenere una soluzione limpida.

5mL del liquido così ottenuto vengono versati in una provetta e accuratamente miscelati con 3mL di anidride acetica (non si osserva alcun cambiamento). Si procede dunque con l'aggiunta di 3-5 gocce di acido solforico concentrato (96-98%), facendolo colare lungo le pareti della provetta.

Si nota un'immediata colorazione blu-verde, che pian piano si intensifica, fino a raggiungere una tonalità verde smeraldo molto molto scura:

Osservazioni: La reazione avviene in diverse fasi: in ambiente fortemente acido, l'anidride acetica acetila il colesterolo (sull'-OH dell'anello A), successivamente avviene una deacetilazione con formazione di un doppio legame. Questa nuova molecola tende a formare dimeri e poi altri polimeri, che sono i responsabili della caratteristica colorazione. Una versione quantitativa del test (che andrà in tal caso eseguito con una procedura specifica di altro tipo) prevede l'utilizzo di uno spettrofotometro per valutare la colorazione e dedurne la concentrazione iniziale di colesterolo nel campione in esame. Una stranezza che ho notato è stato il trasferimento del pigmento giallo del tuorlo al cloroformio in maniera così intensa: qualcuno sa qual è la molecola che dà quel colore? Per ulteriori informazioni: http://www.clinchem.org/content/20/7/794.full.pdf

Davvero molto interessante! Appena mi sarà possibile replicherò l'esperienza!

Che io sappia, dovrebbero essere carotenoidi! Se di allevamento con mangimi coloranti, è anche più probabile.

A proposito, ma non potrebbero disturbare il test?

Beh, quelli che conosco hanno struttura ben diversa dagli steroli, quindi non penso diano falsi positivi. Per le misure spettrofotometriche non so: in teoria carotenoidi e colorazione del saggio positivo vanno su lunghezze d'onda ben distinte, quindi penso che non ci siano grossi problemi, in pratica però non sono affatto esperto di spettrofotometria e non mi sbilancio più di tanto.

Come carotenoidi va bene, ma non potrebbero fare da reagenti anche loro? Io purtroppo di chimica organica non me ne intendo...

Lie·ber·mann Carl Theodore (1842–1914) è stato un chimico tedesco. Liebermann è più conosciuto per il suo lavoro con il collega e chimico Carl Graebe (1841–1927). Il loro lavoro sui coloranti artificiali ha dato considerevole impeto allo sviluppo della moderna industria dei coloranti. Liebermann è stato autore di più di 350 articoli scientifici. Ha investigato i composti della quercetina e del naftalene e preparò derivati alogenati e fenolici. Da quel che ricordo questo test funziona su steroidi insaturi (come il colesterolo) e sui triterpeni; i colori che si formano vanno dal rosa al blu al verde. C'è da dire che questo test ha subito col tempo alcune modifiche poiché la miscela anidride acetica/acido solforico concentrato non è stabile. Ad esempio Huang, Chen, Wefler e Raftery hanno dimostrato che l'uso di una miscela di acido acetico glaciale/anidride acetica/acido solforico concentrato 3/6/1 è più stabile, e non altera il test. Preparata la miscela tripla si aggiunge del sodio solfato anidro (concentrazione 2%). Tipicamente 200 mg di colesterolo per il test sono disciolti in 100 mL di acido acetico glaciale. Come riportato su Nature da Nath, Chakravorty e Chowdhury la formazione del solfato del chetone, che è colorato, alocromico, fu suggerita da Wieland and Weil nello spiegare questa reazione. Il prodotto della reazione, quando versato in acqua, è stato scoperto essere solubile in quest'ultima, e fu osservata la colorazione verde erba. Studiando questo prodotto colorante solubile in acqua, è stato possibile per gli autori affermare definitavamente che è il derivato dell'acido solfonico del colesterilene, che è stato in precedenza riportato essere formato tramite la reazione dell'acido solforico sul colesterolo dissolto in acido acetico glaciale. Questo acido da sali di calcio e bario insolubili. Liebermann and Burchard, Chem. Z., 1, 25 (1890). Wieland and Weil, Ber., 46, 3315 (1913). Nath and Chakravorty, Ann. Biochem. Expt. Med., 2, 73 (1942).