Terreni per microrganismi

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Dott.MorenoZolghetti

2010-11-23 00:49

Per la coltivazione di batteri è possibile ricorrere a due tipi di terreno: quello liquido o brodo e quello solido o agarizzato.

Il brodo nutrizionale di base è così composto:

peptone 5 g

estratto di carne 1 g

estratto di lievito 2 g

sodio cloruro 5 g

acqua distillata fino a un litro.

Il brodo deve essere sterilizzato al termine della preparazione.

Solitamente si ricorre all'autoclave, ma anche una comune pentola con acqua bollente può andare bene, purchè l'acqua sia mantenuta a bollore per quasi un'ora, con dentro, ben somerse le bottiglie di brodo da sterilizzare.

Il terreno agarizzato si ottiene ponendo 15 g di agar in un litro di brodo nutrizionale. Si porta a rigonfiamento l'agar aggiunto a piccole dosi, mescolando continuamente e riscaldando con moderazione.

Quando tutto è limpido si procede a distribuire il prodotto ancora bollente nei rispettivi contenitori (provettoni, matracci, piastre di Petri) affinchè solidifichi nella forma voluta.

Se si desidera un arricchimento è possibile aggiungere alla preparazione su esposta, modificata:

10 g di peptone

5 g di estratto di carne

1 g glucosio

5 g cloruro sodico

0,2 g fosfato potassico

Quindi si mescola bene e si misura il pH che deve essere compreso tra 7,2 e 7,4 (se serve per batteri), oppure compreso tra 4,5 - 5,0 (se serve per muffe). Quando si vuole solido, basta aggiungere 15 g di agar al litro di brodo arricchito.

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NaClO3

2010-11-23 22:23

ma se metti il terreno bollente nella piastra o provetta(becco di clarino), mica mi ammazzi tutto se fai inclusione inglobamento?

Dott.MorenoZolghetti

2010-11-24 19:13

Per fare un agar-germi, il terreno solido deve essere allo stato fuso, ma non bollente...diciamo intorno ai 50-60°C.

Beefcotto87

2010-12-03 12:14

Vorrei sottolineare per l'ennesima volta come non si debba usare la gelatina alimentare, perchè molti batteri la idrolizzano (ovvero diviene liquida e cola ovunque)

NaClO3

2010-12-03 14:33

per questo si usa l'agar agar...

bè, a volte in laboratoriio ho usato l'osteogelatina.

Francesca

2010-12-03 15:23

http://www.biolifeit.com/biolife/main.php?l1=2&p=3

Beefcotto87

2010-12-03 15:33

E' il sito che uso per acquistare :-)

Francesca

2010-12-03 15:59

Allora puoi farci una piccola recensione su questo sito e sulla sua affidabilità, cortesia, celerità! :-)

Dott.MorenoZolghetti

2013-12-01 12:48

In tempi di tumulazioni varie, vado contro corrente e riesumo questa vecchia discussione.

Oltre ai terreni descritti nel primo intervento, sono facilmente reperibili (a costi modesti) terreni già pronti e già dispensati in piaste di Petri. In alcuni casi (agar sangue, agar cioccolato, terreni arricchiti per batteri esigenti) è davvero più economico rivolgersi ai commercianti e acquistarli già pronti.

Nella foto sono esposte tre piastre di Petri contenenti terreni tra i più usati per isolamento e identificazione batterica in campo biomedico.

L'agar sangue, adottato quale sustrato su cui crescono praticamente tutti i batteri non esisgenti, ha il vantaggio di essere anche utile a valutare l'emolisi di alcune specie.

L'agar Mac Conkey, terreno su cui crescono soprattutto le enterobatteriacee, ha le caratteristiche di un selettivo (contiene bile e cristalvioletto come fattori di inibizione) e di un identificativo, consentendo l'identificazione di bacilli lattosio-fermentanti (lattosio e rosso neutro).

L'agar sale-mannite, terreno selettivo (grazie all'alto contenuto di sale) per lo stafilococco, consente di identificare (sommariamente) lo S. aureo per la capacità di fermentare il mannitolo e produrre acidi che inducono un viraggio del rosso fenolo.

Nella foto ci sono anche un terreno liquido (un brodo triptone-soia) e un terreno solido di trasporto in provettoni da batteriologia.

Per completare il quadro si possono vedere alcune tipologie di strumenti per la semina: tampone cotonato, ansa calibrata e un tampone sintetico per spatolamento.

Tra 48 ore (o anche meno, se continuano a pompare acqua bollente nei termosifoni del condominio) potremo vedere le colonie sulle singole piastre.

HPIM2253.JPG
HPIM2253.JPG

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FrancescoReb

2013-12-02 08:06

Qual'è il rischio per la salute dell'uso di terreni di colture? Ho letto che batteri che si organizzano in biofilm sono particolarmente resistenti e quindi pericolosi.. se si fanno colture di questo tipo è sufficiente utilizzare guanti o bisogna prendere altre precauzioni?

Quando ho fatto uno stage in un lab analisi non prendevamo particolari precauzioni però è passato molto tempo e magari ho dimenticato qualcosa!

Dott.MorenoZolghetti

2013-12-02 17:49

Dipende da cosa semini e da cosa cresce. Se sono batteri ambientali o prelevati da uomo sano, il rischio è praticamente zero. Certo, meglio non usare le brodocolture come collirio. ;-)

Beefcotto87

2013-12-02 18:31

Quanta voglia di ricominciare... Oggi abbiamo avuto a che fare con un E. coli ceppo BL21, con plasmide pGEX-4T1 (di cui ho la mappa, se interessa XD)!

Dott.MorenoZolghetti

2013-12-03 15:43

Ecco la prima foto: colonie di flora mista Gram negativa su agar MCK.

Qualcuno vuole tirare a indovinare? ;-)

HPIM2265.JPG
HPIM2265.JPG

Beefcotto87

2013-12-03 20:38

Come mi ha insegnato Lei, Dottore, senza ulteriori prove non c'è certezza di nulla ;-)

L'unica cosa, è che c'è flora mista fermentante e non fermentante il lattosio, è l'unica cosa che mi sento di dire! Dov'è che è stato preso il campione?

Dott.MorenoZolghetti

2013-12-04 22:32

Perfetto Beef, è quello che dovevi dire. Altro non si può affermare, senza temere smentite.

Coprocoltura.

Beefcotto87

2013-12-05 07:49

Grazie :-)

E allora c'è di tutto e di più XD Coprocoltura da paziente sano? (lo chiedo giusto per curiosità)

Dott.MorenoZolghetti

2013-12-05 21:21

Ecco le foto delle altre due piastre.

Agar sale-mannite e agar sangue.

Sull'agar sangue ci sono poche colonie di streptococco spp., mentre sul sale-mannite si contano numerose colonie di stafiloccocco spp.


Non sono colture pure neppure queste, ma derivano da prelievi ambientali (maniglie, monete, ecc.)

HPIM2291.JPG
HPIM2291.JPG
HPIM2292.JPG
HPIM2292.JPG

Beefcotto87

2013-12-05 21:23

Non riesco a vedere, le piccole colonie sull'agar sangue, quelle di Streptococcus ssp., che emolisi presentano?

Dott.MorenoZolghetti

2013-12-05 21:26

Nessuna emolisi, anemolitico direi...


Inoltre sta crescendo una colonia di miceto muffoso...
La coprocultura è priva di patogeni di rilievo, nessuna salmonella.

Beefcotto87

2013-12-05 21:32

Ecco, vedi la colonia su agar sangue che ha un aspetto irregolare e grigiastro? Hai altre informazioni su di essa?

Dott.MorenoZolghetti

2013-12-05 21:36

Quella con le due colinie bianche satelliti? E' la muffa.

Se invece ti riferisci a quella in alto a ore 10, non ne so troppo, potrei azzardare e ipotizzare sia un corinebatterio spp.

Beefcotto87

2013-12-05 21:40

Parlavo esattamente di quella batterica in alto a sinistra! Ecco, anche a me ne sono uscite alcune, a volte... Altra cosa, sulla piastra di agar sale-mannitolo, vedo delle grosse colonie, frastagliate e grigie, che fermentano il mannitolo (credo); anche quelle mi sono "assai" note, tu hai avuto modo di studiarle?

Dott.MorenoZolghetti

2014-01-02 17:28

Vorrei proporvi alcuni terreni facilmente realizzabili e adatti alla coltura di miceti.

Il primo è l'agar di Sabouraud, costituido da:

- 40 g di destrosio,

- 10 g di peptone da micologia,

- 15 g di agar

- 1000 mL di acqua

Si disciolgono i componenti in acqua tiepida e in ultimo di versa l'agar, quindi si scalda senza bollire, fino a quando l'agar si sia gonfiato e sciolto completamente.

A questo punto si lascia raffreddare a circa 50 °C e si porta a pH 5,6 con HCl conc. (poche gocce bastano). Quindi si versa in piastre. Avendo la possibilità, è meglio autoclavare il terreno per 15 min. a 120 °C o per 60 min a 105°C.

Altro terreno utile è quello di Czapek e Dox, composto da:

- saccarosio 30 g,

- sodio nitrato 3 g,

- potassio fosfato monoacido 1 g,

- magnesio solfato eptaidrato 0,5 g,

- potassio cloruro 0,5 g,

- ferro (II) solfato eptaidrato 0,01 g,

- agar 15 g,

- acqua distillata 1000 mL.

Disciogliere i componenti e per ultimo l'agar riscaldando un po'. Aggiustare il pH a 7,3.

Idem come sopra.

Altro facile facile è l'agar malto:

- estratto di malto 20 g,

- agar 15 g,

- acqua distillata 1000 ,L

Stesse osservazioni.

Termino con l'agar di Gordkowa, adatto alla sporulazione dei miceti. E' composto da:

- destrosio 25 g,

- estratto di manzo 10 g,

- peptone da micologia 10 g,

- sodio cloruro 5 g,

- agar 15 g,

- acqua distillata 1000 mL.

Valgono le stesse osservazioni.

Se qualcuno fosse interessato, posso fornire piccole quantità di terreni disidratati per fare qualche prova. Tenete presente che estratto di malto, agar, destrosio si possono facilmente reperire in negozi generici (tipo bio e simili, erboristerie, forniture per atleti/palestra, ecc.) Saccarosio, estratto di carne e cloruro di sodio li trovate, rispettivamente come zucchero, estratto Liebig e sale fino, nel negozio di alimentari sotto casa. Il solfato di magnesio in farmacia.

I seguenti utenti ringraziano Dott.MorenoZolghetti per questo messaggio: Beefcotto87, NaClO

Dott.MorenoZolghetti

2014-01-04 07:04

Una semplice "autoclave" può essere realizzata impiegando una pentola a pressione, in cui sul fondo venga inserito un distanziatore (una rete metallica, per esempio) per evitare che gli oggetti siano in contatto diretto con il fondo della pentola. E' bene invece che i materiali da sterilizzare siano immersi nel vapore e non nell'acqua posta sul fondo. La temperatura raggiunta dal vapore è di circa 105°C e deve essere mantenuta almeno per 60 minuti. La pressione interna raggiunge circa 1,5 atm. Non sono necessari nè manometro, nè termometro, ma è utile impiegare solo acqua distillata per evitare incrostazioni. Durante l'uso della pentola (inventata da Papin) è FONDAMENTALE assicurarsi che la valvola di sfogo del vapore sia pervia e funzionante e che sul coperchio esista una valvola di sicurezza (solitamente di colore rosso o non colorata nei modelli più datati).

I seguenti utenti ringraziano Dott.MorenoZolghetti per questo messaggio: Beefcotto87

Beefcotto87

2014-01-04 10:20

Dovrò comprarmi una pentola a pressione! Anche se, in realtà, uso più spesso materiale "usa & getta". Per i miceti, se non vi è necessità di riconoscimento fino alla specie, penso basti qualsiasi materiale vegetale (come il the usato ;-) )

Dott.MorenoZolghetti

2014-01-05 07:43

Eh, vada per l'agar the allora! ;-)

L'usa e getta rappresenta un'ottima soluzione, ma ha costi un po' più elevati, anche se ancora compatibili con la vita. :-)

-push-

2014-01-24 20:31

Beefcotto87 ha scritto:

Quanta voglia di ricominciare... Oggi abbiamo avuto a che fare con un E. coli ceppo BL21, con plasmide pGEX-4T1 (di cui ho la mappa, se interessa XD)!

Mi piacerebbe molto vedere la mappa del plasmide che hai citato, posso chiederti di postarla ? Ti ringrazio :-) :-) :-)