Una chiacchierata su: Neuraminidasi e loro meccanismo enzimatico
Buonasera, o buongiorno, a seconda dei vostri ritmi circadiani, oggi si parla di Neuraminidasi Influenzali, ai meno conosciute come eso-alfa-sialidasi influenzali (EC 3.2.1.19).
Si tratta di una discussione aperta a consigli e che spero di aggiornare al più presto con un bel po' di informazioni. Intanto lascio qui lo spunto che Claudio G. mi ha dato quando si stava discutendo di tutt'altro.
Lascio tutti i messaggi intonsi:

Io:

Citazione:
(l'ho disegnato perché i programmi di disegno molecolare fanno le frecce di spostamento elettronico bruttissime)
Ma no, ma no... un po' di smanettamento e le frecce su Chemscketch escono bellissime, lo sto utilizzando proprio ora per il progetto di maturità.
[Immagine: attachment.php?thumbnail=16386]   
Scusate il parziale OT.


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Claudio:


Mercaptano Ha scritto: Ha scritto:Ma no, ma no... un po' di smanettamento e le frecce su Chemscketch escono bellissime, lo sto utilizzando proprio ora per il progetto di maturità.

Scusate il parziale OT.

Uh anvedi, buono. Io son solito usare MarvinSketch, che davvero fa delle frecce bruttissime. Però proverò, grazie per il consiglio [Immagine: wink.gif]


Uh, è una sialidasi quella? Scusa se ti faccio un appunto, ma in quell'intermedio non dovrebbe entrare direttamente acqua, con attacco sul C1 e rottura del legame alla tirosina? Cioè se ho capito bene tu intendi far attaccare nel passaggio successivo il carbocatione (che formi con gli spostamenti indicati) dall'ossidrile, quindi un attacco Sn1. Però nota anche (probabilmente lo avrai già considerato, ma nel dubbio...) che è pure possibile un meccanismo Sn2 (vedi il caso scuola della catalisi da lisozima), e che di norma nelle glicoside idrolasi è preferito, perché evita la formazione di cariche nette   [Immagine: smile.gif]


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Io: 

Citazione:
Uh anvedi, buono. Io son solito usare MarvinSketch, che davvero fa delle frecce bruttissime. Però proverò, grazie per il consiglio [Immagine: wink.gif]

Uh, è una sialidasi quella? Scusa se ti faccio un appunto, ma in quell'intermedio non dovrebbe entrare direttamente acqua, con attacco sul C1 e rottura del legame alla tirosina? Cioè se ho capito bene tu intendi far attaccare nel passaggio successivo il carbocatione (che formi con gli spostamenti indicati) dall'ossidrile, quindi un attacco Sn1. Però nota anche (probabilmente lo avrai già considerato, ma nel dubbio...) che è pure possibile un meccanismo Sn2 (vedi il caso scuola della catalisi da lisozima), e che di norma nelle glicoside idrolasi è preferito, perché evita la formazione di cariche nette   [Immagine: smile.gif]

Sì, hai perfettamente ragione, secondo l'ultima proposta accreditata sarebbe così, però ci sono un po' di cose che non tornano dai paper che ho letto. 

Si tratta di una sialidasi virale, in particolare, che a quanto pare dalle cristallografie a raggi X e dalle simulazioni ha di mezzo anche un osso-carbocatione sialosilico stabilizzato dal sito attivo e che per la sua formazione prevede un aspartato protonato (ASP 151) che funga da catalizzatore acido-base.

Il problema è che non sono presenti evidenze (o forse sono io che davvero non riesco a comprenderlo ahah) di come possa venir protonato questo ASP 151, dunque ho scritto sia una ipotesi basata sul primo paper di Taylor et al., quella che vedi sopra, dove a mediare l'inizio della catalisi sono ARG152 e ASP151 che orientano l'acqua in maniera tale da permettere l'attacco da parte di un doppietto dell'ossigeno del legame glicosidico nei confronti del protone. 

Poi dunque dopo la formazione del catione sialosilico, l'allontanamento della catena oligosaccaridica -OR, e la formazione dell'intermedio covalente, l'ossidrile rimasto, stabilizzato dall'arginina e da altri residui, attacca il carbonio anomerico permettendo la rottura del legame tra tirosina e acido sialico (dopo quindi c'è il distacco del prodotto e la sua mutarotazione in anomero beta), in quest'ultima serie di passaggi, ho incorporato anche le evidenze di un intermedio covalente, non citate da Taylor in quanto non era stata ancora dimostrata questa teoria. 

Subito sotto la proposta personale (con citazioni a supporto e presa molto con le pinze, perché non sono certo in grado di validarla sperimentalmente), ho riportato l'ipotesi di Mark Von Itzstein et al. secondo cui, come dici tu è una molecola d'acqua a mediare la rottura del complesso sialosil-enzima e nella fasi precedenti, invece, è l'ASP151 protonato a fornire il protone per l'inizio della catalisi.

Per il discorso sul lisozima, iniziando a studiare le sialidasi influenzali sono rimasto interdetto anch'io, poi ho letto meglio e praticamente non si riformerebbe il catione sialosilico (che invece figura in tutte le proposte anche dopo la rottura dell'intermedio covalente).

P.S. se magari apro un'altra discussione, si può fare una bella chiacchierata sulle proposte di meccanismo per le sialidasi, che sono davvero affascinanti. Ho anche pronte una valanga di immagini [Immagine: asd.gif] .

EDIT: ora che ci penso, si avrebbe anche una inversione di configurazione con l'approccio Sn2, o sbaglio? Mentre qui il prodotto dovrebbe rimanere nell'anomero alfa


Se è davvero troppo OT, magari qualcuno può splittare la discussione??


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E qui si conclude lo scambio di messaggi, chiunque si voglia unire alla discussione è benvenuto, domattina mi ci metto e carico parte del commento che ho scritto per la maturità, intanto lascio le immagini del meccanismo di reazione secondo Mark Von Itzstein, dell' Institute for Glycomics della Griffith University, in Australia. Riporto il meccanismo in ordine nelle tre immagini da sinistra verso destra.
         
Il modello qui riportato si avvale per la descrizione dello stereocentro del C6 di legame stereochimico indefinito, in quanto la rappresentazione dell’anomero α sarebbe complicata e confusionaria con i metodi grafici utilizzati. Nota: nell'ultimo passaggio ho omesso la formazione di un complesso con conformazione a barca dell'anomero alfa di acido sialico con l'enzima (che poi è il complesso enzima-prodotto finale da cui si distacca il composto in conformazione a sedia) 
"Perennemente indeterminato come Heisemberg"
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ClaudioG., luigi_67, TrevizeGolanCz
Con la maturità alle spalle e il neo-acquisito titolo di "perito in chimica e biotecnologie sanitarie", ho finalmente il tempo di parlare un po' di queste benedette sialidasi.

Dunque, direi di partire dalle basi: ecco il meccanismo di reazione da me proposto e la relativa spiegazione.
             

È noto da studi condotti in silico e in vitro, con l’aiuto di diffrazione a raggi X, che la reazione di idrolisi di glicosidi terminali di Neu5Ac procede in diversi passaggi, i cui punti critici sono la formazione del catione sialosilico e di un intermedio covalente.
Quanto riportato è un meccanismo proposto in accordo con le attuali evidenze scientifiche, ulteriori studi sono richiesti per provarne la validità assoluta, in quanto vi sono diverse possibilità sul procedere della reazione al di fuori dei dati propriamente accertati.
1)     Il processo inizia con la conversione della struttura a sedia, tipica degli anelli acetalici dei piranosi, in una meno comune conformazione a pseudo-barca (distorted boat), che presenta maggiori ingombri sterici ed è energeticamente sfavorita in una normale soluzione acquosa.Questo processo è mediato dall’azione dei residui amminoacidici del sito attivo, che agiscono distorcendo la struttura a sedia attraverso legami a idrogeno, interazioni idrofobiche, formazione di ponti salini e di legami a idrogeno tra ligando, acqua e residui amminoacidici (comunemente detti water bridges, letteralmente “ponti d’acqua”).In particolare, sia grazie alle evidenze del docking molecolare eseguito sull’acido sialico, sia grazie ai dati in letteratura, si sono individuate le principali interazioni che stabilizzano la conformazione a pseudo-barca:Ricoprono un ruolo fondamentale:
   a.     Il cluster formato da ARG 318, ARG 371 e ARG 292, i cui cationi guanidinio (protonati a pH fisiologico)  interagiscono in maniera molto forte con lo ione carbossilato di Neu5Ac, formando ponti salini e legami a idrogeno.Tale interazione è fondamentale poiché permette il passaggio del gruppo carbossilato dalla tipica posizione assiale alla sfavorita posizione equatoriale.   
b.     L’ARG 152 (la cui attività è implicata anche nei successivi passaggi del meccanismo) che interagisce con l’ossigeno carbonilico del gruppo N-acetile.    
c.      GLU 276 che interagisce mediante legami a idrogeno con i due ossidrili di C8 e C9, stabilizzando la struttura e impedendo che si formino ingombri sterici.    
d.    TRP 178 e ILE 222, che interagiscono con la porzione apolare del gruppo N-acetile (interazioni idrofobiche).

Il resto delle interazioni non covalenti che si formano tra proteina e ligando è omesso nelle immagini di cui sopra. Nelle immagini relative al meccanismo di reazione, si riportano soltanto il cluster di arginine e i residui direttamente interessati in meccanismi catalitici.
2)     

    a.      Nella seconda fase intermedia della reazione, in accordo con gli esperimenti di Taylor et al. , si propone un meccanismo di reazione nel quale le interazioni dei legami a idrogeno di ASP 151 e ARG 152 risultano di fondamentale importanza, potendo questi interagire con una molecola d’acqua e favorendo l’attacco da parte di un doppietto dell’ossigeno glicosidico  nei confronti di un protone dell’H2O. L’avvenire di tale processo (ovvero la creazione di un catione sialosilico), sarebbe energeticamente sfavorevole, ma risulta possibile grazie alla formazione di una rete di legami a idrogeno tra intermedio cationico, acqua e residui amminoacidici.
b.      Si noti come la proposta (a) sia formulata assumendo l’ambiente di reazione come a pH fisiologico, anche se sono noti casi di eso-α-sialidasi stabili a pH fortemente acidi (si veda il tratto intestinale degli uccelli, nel quale virus come l’H5N1 dell’aviaria proliferano). A tale proposito, sono state avanzate proposte di meccanismi che involvono una catalisi acido-base classica al posto dell’impiego di una molecola d’acqua in queste prime fasi della reazione chimica.
3)     La terza fase del meccanismo proposto si basa sulle evidenze scientifiche ottenute da praticamente tutte le ricerche attualmente in letteratura e dall’attività accertata dei più comuni inibitori delle sialidasi virali.Si prevede quindi, in questo passaggio, il distacco della catena poli-/oligo-saccaridica (R-OH nello schema di reazione) dal sito attivo e la formazione di un osso-carbocatione ciclico stabilizzato dalle interazioni polari e apolari del sito attivo, tale intermedio è meglio noto come catione sialosilico e presenta una tipica conformazione tridimensionale a semi-sedia, con una porzione dell’anello resa planare dal doppio legame creatosi tra C2 e ossigeno emiacetalico (oltre che dalla rete di interazioni polari/apolari con i residui, questa struttura è anche stabilizzata per risonanza). Lo stadio di transizione tra le varie fasi di questo passaggio è stabilizzato dai residui del sito attivo e dalle molecole d’acqua.
 
4)     Il modello proposto da Taylor et. al. diverge da quanto segue, poiché all’epoca della pubblicazione, non vi erano prove della creazione di un intermedio sialosil-enzimatico, e fu ipotizzato solo che TYR 406 agisse come stabilizzatore del catione mediante interazioni polari.Recentemente, però, a seguito degli esperimenti di inibizione covalente delle neuraminidasi con fluoroderivati di Neu5Ac (ref. Bibliografica: Vravricka et al., Von Itzstein et al.), è stato dimostrato in maniera definitiva che la formazione di un intermedio covalentemente legato all’enzima è un passaggio fondamentale del meccanismo enzimatico e che il residuo coinvolto in questo processo è TYR 406, sempre conservato in ogni sottotipo e isoforma virale dell’enzima.  Tale residuo può essere inibito covalentemente in maniera efficace da analoghi fluorurati dell’acido sialico.In accordo con la struttura tridimensionale del complesso tra sito attivo e catione sialosilico, TYR 406 è il residuo posto nella posizione più adeguata a formare un legame covalente mediante attacco nucleofilo al carbonio anomerico C2.Il meccanismo proposto prevede che ad attivare l’ossigeno nucleofilo sia GLU 277, in grado di deprotonare l’ossidrile fenolico di TYR406 e renderlo quindi un buon nucleofilo.Il processo dovrebbe decorrere quindi con un ritorno temporaneo alla conformazione a barca dell’intermedio legato all’enzima, con il mantenimento di una forma α anomerica.
In tale maniera dovrebbe verificarsi inoltre la possibilità per ROH di distaccarsi definitivamente dal sito attivo, non essendo più coinvolto nella rete di interazioni polari tra intermedio e residui amminoacidici.In parallelo, l’ossidrile che successivamente si dovrebbe legare al C2 risulta stabilizzato da ARG 152, in accordo con Taylor et. al.
5)     Nel passaggio successivo, dunque, si verifica esattamente il meccanismo inverso dell’attacco nucleofilo di TYR406, infatti il doppietto dell’ossigeno che collega enzima e intermedio strappa il protone che aveva precedentemente ceduto a GLU 277 (secondo meccanismo classico acido-base), portando al rigenerarsi del catione sialosilico e del residuo catalitico di tirosina. Si noti che qui è proposto un approccio del tipo SN1, nel quale si hanno, in due fasi diverse: la rottura dell’intermedio e, come esposto di seguito, l’attacco nucleofilo dell’ossidrile sul C2. È proponibile anche un meccanismo differente, per il quale si ha l’attacco dell’ossidrile con approccio SN2, ma ciò presupporrebbe un’inversione di configurazione dell’anomero e perciò non sarebbe in linea con le evidenze della formazione finale di α-Neu5Ac.6)     L’ossidrile derivato dalla molecola d’acqua iniziale, stabilizzato dall’ARG 152 è in grado di attaccare il C2, con formazione del prodotto finale Neu5Ac in configurazione α-anomerica. In realtà, a questo stadio del processo, si rigenera la conformazione a pseudo-barca con anomeria α, che però va incontro a ulteriori cambiamenti della conformazione e si distacca dal sito attivo assumendo conformazione a barca (questo passaggio è omesso nell’immagine).Si ipotizza che quest’ultima, per mutarotazione, dia origine in soluzione all’anomero β, più stabile, giustificando la concentrazione al 90% in soluzione di questa configurazione della molecola (prove in vitro), seppur l’enzima dia come prodotto finale della catalisi la forma α.
Come già accennato, le due alternative a quanto proposto qui sopra sono quelle che prevedono:
  1.     Un dualismo tra meccanismi catalitici diversi (probabilmente pH dipendenti).
  2.     Modelli totalmente distinti basati su diverse interazioni tra i residui amminoacidici funzionali.
In particolare, molti paper, al posto del meccanismo proposto, riportano un residuo acido protonato (ASP 151) che potrebbe catalizzare le prime fasi del processo (al posto della molecola d’acqua sopra impiegata).
Analogamente, secondo questo modello, nelle fasi finali un residuo carico negativamente agirebbe da base di Brønsted-Lowry su una molecola d’acqua, strappandovi un protone e inducendo l’ossigeno ad attaccare il C2 del catione sialosilico (ref. Bibliografica: “The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors”, Mark von Itzstein, e “Enzymology of Influenza Virus Sialidase”, Chan et al.).
Questo modello è attualmente quello più accreditato, seppur si basi su osservazioni per lo più indirette e sia ancora sotto studio. Risulta di fondamentale importanza, in tal senso, l’attività di ASP 151 come debole catalizzatore acido. Di certo, è accreditata e dimostrabile la formazione dell’intermedio covalente, come riportato nelle immagini. 
Si ipotizza che questo processo sia di fondamentale importanza perché il prodotto di reazione R-OH (ovvero il resto dell’oligo- o poli-saccaride da cui si distacca Neu5Ac), possa allontanarsi dal sito attivo in un tempo ragionevole.
Difatti, al contrario che in molte glicosidasi in cui l’intermedio covalente coinvolge spesso carbossilati amminoacidici, nelle neuraminidasi virali il legame tra TYR 406 e substrato è più duraturo, essendo la tirosina un peggior gruppo uscente rispetto al carbossilato di residui come GLU o ASP.
D’altra parte, però, Taylor et. al., come accennato prima, propongono la stabilizzazione dell’intermedio enzima-substrato esclusivamente mediante interazioni non covalenti e senza l’intervento di residui funzionali che agiscano direttamente con meccanismo acido-base e/o nucleofilo.
Sulla base delle evidenze sperimentali e dei modelli cristallografici a pH fisiologico umano, non sono stati individuati residui acidi in grado di agire da donatori di protoni per il modello proposto (come evidenziato anche in seguito, ASP 151 è deprotonato nell’ambiente fisiologico dell’apparato respiratorio umano, dunque non potrebbe soddisfare i requisiti richiesti dall’ipotesi di Mark von Itzstein).
In accordo con questa osservazione, è stato elaborato il meccanismo sopra riportato, sulla base delle ricerche consultate e dei dati in esse riportati. È certo che ulteriori sperimentazioni siano fondamentali per venire a capo di questo meccanismo catalitico.

Nel messaggio iniziale, ho allegato il meccanismo di Von Itzstein che fa uso dell'ASP 151 protonato.
"Perennemente indeterminato come Heisemberg"
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