Gc e HPLC

Mi chiedevo se qualcuno potrebbe spiegarmi  perchè nel GC posso usare una colonna(30-100m) capillare  e una impaccata (1-5m)mentre in HPLC sono obbligato a usare una colonna Impaccata di pochi cm!!!

Grazie mille

Mi chiedo sempre, ma non vi insegnano nulla a scuola?

Innanzitutto spero tu sappia la differenza tra GC e HPLC.

La tipica colonna capillare per GC ha un diametro interno di circa 0.25 mm, una tipica copertura polimerica della fase stazionaria sulla parete interna di 250 nm. L'elevata velocità di diffusione degli analiti nella fase gas permette una rapida ri-equilibrazione su tali distanze. La diffusione in un liquido è molto più lenta. Se compensiamo riducendo le dimensioni di un sistema LC capillare sufficientemente da ottenere le condizioni desiderate di ri-equilibrazione, essere sarebbero davvero molto piccole, con un calibro misurato in pochi micron. Per avvicinarci ad un rapporto tra fasi simile alla GC, la copertura della fase stazionaria deve ridursi ad un spessore di diversi nanometri. Questo è nel range di dimensioni di singole molecole. Una colonna LC tubolare aperta con tali dimensioni avrebbe una capacità di carico del campione davvero minima prima di saturarsi, e sarebbe davvero difficile costruire un detector in grado di lavorare su una tale piccola scala! Detector in grado di processare volumi maggior introdurrebbero gravi allargamenti di banda extra-colonna o richiederebbero aggiustamenti estesi sul flusso che diluirebbero ulteriormente le già minuscole concentrazioni di analita eluite da una tale colonna. HPLC capillare è possibile quando i campioni sono limitati a quantità davvero esili, ma non si avvicinano per niente ad una comune colonna capillare per GC.

Il modo per aver successo con l'HPLC è tornare alle colonne impaccate, ma implementandole con particelle di supporto e dimensioni della copertura della fase stazionaria molto minori rispetto a quelle delle colonne impaccate per GC. Si impiegano particelle monodisperse sferiche di silice di diametro uniforme compreso tra 2 e 10 micrometri. Lo spazio poroso tra le sfere impaccate a stretto contatto sarà di dimensioni simili. Diversamente da quanto accade in GC, queste particelle usate in LC spesso hanno una porosità interna secondaria su scala minore di canali all'interno dei quali le particelle permeano (si diffondono). Mentre la fase stazionaria in GC è un vero polimero quasi-liquido delle dimensioni di quasi tutte le molecole, in LC è uno strato organico monomateriale chimicamente legato ai gruppi silanolici liberi presenti sulla superficie silicea. Tipicamente si usa un n-C18 o ODS.

Differenze tra fasi stazionarie impaccate o capillari in HPLC e GC:

1. Ogni molecola della fase LC è legata chimicamente alla superficie del suo supporto solido, ma meno spesso è cross-linked.

2. La fase HPLC è così sottile che non è un fluido totalmente randomizzato, come una copertura polimerica in GC.

3. Di solito è impossibile, visto l'ingombro sterico o l'aumento di affollamento, attaccare una molecola [come il gruppo -O-Si-(CH₃)₂C₁₈H₃₇] ad ogni silanolo libero che si lega al sito sulla superficie silicea.

4. Questi siti silanolici non reagiti giacciono molto più vicino alla fase mobile rispetto a quanto accade in GC, e possono facilmente agire da siti attivi facendo passare in secondo piano la GC.

5. I siti attivi non reagiti sulla superficie di supporto devono essere mascherati facendoli reagire con un gruppo molto corto [come un -Si-(CH₃)₃] che può penetrare per reagire e legarsi con la maggior parte dei gruppi silanolici rimanenti: si parla di endcapping.

6. Non appena la composizione della fase mobile liquida è variata, può interagire per causare alterazioni nell'allineamento delle molecole della fase stazionaria, ed in tal modo interessare il loro comportamento di partizione con alcuni analiti. Questa dipendenza del comportamento della fase stazionaria rispetto alla composizione della fase mobile non è riscontrato in GC, ed aggiunte ulteriore complessità alla predizione del comportamento di separazione in HPLC.

7. La piccola dimensioni dei pori tra le particelle delle colonne HPLC richiede particelle stabili, uniformi, sferiche evitando così che si aggreghino in maniera tale da bloccare il flusso uniforme attraverso questi stretti passaggi. I solventi della fase mobile vanno filtrati per rimuovere le particelle delle dimensioni di micrometri che potrebbero occludere questi pori interstiziali e bloccarli o incanalare il flusso della fase mobile.

8. I gas dissolti nella fase mobile potrebbero uscire dalla soluzione e formare bolle non appena la pressione cambia dall'entrata all'uscita della colonna. Quelle bloccheranno o incanaleranno il flusso, diminuendo la risoluzione o anche bloccando la colonna completamente. Anche se le bolle si dissolvessero, la risultante grande cavità nell'impaccamento potrebbe introdurre allargamenti di banda extra-colonna. I liquidi della fase mobile devono essere degassati prima dell'uso, filtrandoli sotto vuoto o gorgogliando al loro interno un flusso di piccole bolle di gas elio debolmente solubile.