Degradazione di Edman
Il sequenziamento di una proteina o un peptide (l'ordine in cui gli amminoacidi sono disposti in un peptide) è un importante tecnica non solo per comprendere come sia fatta tale molecola, ma anche per capire che conformazione questa assumerà e soprattutto come reagisce con l'ambiente spesso costituito da molecole non-proteiche o non-peptidiche.

Uno dei metodi di sequenziamento è sicuramente la nota degradazione di Edman in cui la parte N-terminale di un peptide viene legata ad un reagente ed è in seguito scissa dal peptide senza intaccare però i restanti legami peptidici all'interno della macromolecola. Si ottiene così un residuo che contiene l'amminoacido non più legato al peptide ed è possibile a questo punto analizzarlo. Questa tecnica rimane un approccio unico che può portare a nuovi dati sul sequenziamento di una proteina. È inoltre la tecnica preferita per la conferma dell'espressione proteica in quanto è veloce.
La chimica di questo approccio fu per la prima volta introdotta nel 1950 da P. Edman della Lund University in Svezia e fu sviluppata in seguito durante il suo lavoro a Melbourne, Australia dove si ritiene fu per la prima volta automatizzato il metodo tramite un dispositivo che permetteva il sequenziamento proteico.

P. Edman, Acta Chem. Scand. 4, 283 (1950).

Chiedo venia per l'immagine che fa un po' schifo ma non avevo voglia di cercarne di migliori... Magari un'altra volta *Fischietta*

[Immagine: EdmanMech.gif]

Il fenile isotiocianato reagisce all'estremità N-terminale del peptide con il residuo amminoacidico in condizioni basiche (N-metile piperidina/MeOH/H2O) a formare un feniltiocarbamile derivato (PTC-proteina). L'acido trifluoroacetico (TFA) scinde quindi il primo amminoacido come anilinotialinone derivato (AZT-amminoacido) e lascia libero un nuovo residuo amminico pronto per un nuovo ciclo di degradazione.
L'amminoacido AZT è quindi rimosso tramite estrazione con etile acetato e convertito in feniltioidantoina derivato (PTH-amminoacido) con TFA 25%/H2O. Si formano inoltre diversi sottoprodotti*.

L'amminoacido-PTH è quindi trasferito in HPLC (colonna C18, a fase inversa) per essere analizzato tramite UV (lettura a 270 nm).
Una miscela standard di 19 amminoacidi è anch'essa iniettata in colonna per la separazione (di solito è la prima iniezione che viene fatta oltre ad essere il primo run dello strumento). Questo cromatogramma fornisce i tempi di ritenzione di ogni amminoacido per paragone con il cromatogramma di ogni ciclo di degradazione di Edman.
Per determinare l'amminoacido presente ad un particolare numero di residuo, il cromatogramma dei residui di interesse è comparato con il cromatogramma del residuo precedente sovrapponendo l'uno sull'altro. Da questo può essere determinato l'amminoacido per un particolare residuo.

Questo processo è pratico se si determinano dai 20 ai 40 amminoacidi in una sequenza peptidica. C'è anche chi dice si possa arrivare a 50 amminoacido ma già a questo numero diventa poco conveniente usare tale metodo.

E allora quando si hanno più di 40 o 50 amminoacidi in un peptide? Come si fa?

Beh, innanzitutto si usano metodi automatizzati. Ormai in ogni laboratorio che si rispetti si usano sequenziatori automatici controllati da pc degni di esser chiamati tali asd.
E poi si ricorre a metodi enzimatici di idrolisi per spaccare grosse sequenze di amminoacidi in sequenze più piccole e quindi facilmente degradabili ed analizzabili.

* Analizzo brevemente i sottoprodotti che tendono a sporcare la miscela analizzata in HPLC.
Come detto sopra, usiamo acqua assieme ad altri reagenti per aver un NH2 libero di reagire con il fenile isotiocianato ma l'acqua idrolizza l'isotiocianato facendoci ottenere di nuovo l'anilina. Questa reagisce con il fenile isotiocianato a dare la difeniltiourea (DPTU), la quale si ossida facilmente a difenilurea (DPU). Non essendoci più isotiocianato disponibile la degradazione si ferma, rendendo inutile il metodo.
Inoltre poiché si usa il MeOH, abbiamo anche in questo caso reazione con l'isotiocianato a dare l'N-fenil,O-metil-tiocarbonato (PMTC).
Sensa schei né paura ma coa tega sempre dura
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[-] I seguenti utenti ringraziano quimico per questo post:
marco the chemistry
Ciao quimico! Volevo farti i miei complimenti per il post informativo che hai inserito in questa sezione del forum.. :-) Se posso permettermi ti allego una foto che ho trovato alquanto chiara ed esaustiva..che ne dici?

[Immagine: EdmanDegradation.png]
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